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为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。 相似文献
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根据经典和新型水禽呼肠孤病毒σA基因的保守序列设计一对PCR引物,通过优化病毒RNA提取方法和PCR条件,建立了番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法。该方法可自1株经典型或4株新型水禽呼肠孤病毒特异性扩增出436 bp条带,其最低病毒检出量为3.6 TCID50,而对鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒、番鸭细小病毒、产蛋下降综合征病毒和H9N2亚型禽流感病毒扩增均为阴性。对2011~2012采集的224份(番鸭74、鹅68、鸭82)疑似临床病料进行检测,结果 56份为阳性,番鸭、鸭和鹅阳性率分别为59.5%(44/74),11.0%(9/82)和4.4%(3/68),表明水禽呼肠孤病毒主要在番鸭中流行。 相似文献
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【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)~(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。 相似文献
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为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)的快速检测方法,本研究基于该病毒囊膜蛋白(M)基因序列的保守区域,经优化反应条件,对检测方法的特异性、敏感性及重复性进行了测定,建立了一种用于检测BATV的一步法RT-PCR快速诊断方法。所建立的检测方法可特异性扩增出BATV M基因480bp的序列片段,其最低检测病毒量为1×10~(1.1) TCID_(50),且重复性好,对禽坦布苏病毒、鸭甲肝病毒等5种鸭常见传染病病原均未扩增出相应的片段,特异性好。以上结果表明,所建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性和敏感性,可用于鸭BATV感染的早期快速诊断及流行病学调查。 相似文献
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本研究旨在建立一种快速、敏感和高特异性检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肠炎病毒(DEV)和番鸭细小病毒(MDPV)的TaqMan三重实时荧光定量PCR(q-PCR)的诊断方法并应用于临床疑似样品检测。根据DTMUV的E基因、DEV的UL2基因和MDPV的VP3基因保守区域,分别设计合成了3对特异性引物和探针,在建立单重q-PCR方法的基础上建立了三重q-PCR方法。运用三重q-PCR方法对198份来自江苏和安徽的鸭组织疑似病料进行检测,结果表明,建立的TaqMan三重q-PCR可同时检测这3种病毒,检测灵敏度至少达100个拷贝,相关系数(R~2)均在0.99以上,扩增效率为90%～110%。同时,该方法对H9亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)、鸭甲肝病毒Ⅰ型(DHAV-1)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、新城疫病毒(NDV)、鹅细小病毒(GPV)的检测均为阴性,表明该方法具备特异性强、灵敏度高、重复性好和快速等优点。与常规PCR检测方法相比,三重q-PCR方法灵敏度大约高100倍。临床疑似样品检测结果表明DTMUV的检出率最高,3种病毒混合感染亦常见。建立的TaqMan三重q-PCR检测方法为DTMUV、DEV和MDPV的临床样品检测提供了快速、有效、特异和灵敏的工具,也为临床分子流行病学调查及定量分析奠定了基础。 相似文献
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Ⅰ型鸭病毒性肝炎RT-PCR检测方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ/06强毒株的测序结果,在其基因组3D基因区设计合成一对可扩增238 bp的特异性引物,成功的建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了其特异性与敏感性,对DHV-Ⅰ分离毒株和临床病料进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原:鸭瘟病毒、鸭产蛋综合症病毒、鸭副粘病毒、鸭里默氏杆菌均未扩增到任何片断。利用BHK-21细胞、SPF鸡胚对DHV-Ⅰ临床病料进行病毒分离鉴定,结果表明建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点。 相似文献
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根据Genbank收录的I型鸭肝炎病毒(DHV-I)的VPI基因保守序列,设计合成特异性引物,建立了检测DHV-I的RT-PCR方法.并确定了该方法的特异性与灵敏性;对DHV-I分离毒株进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果.而作为阴性对照的常见4种鸭病病原如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、鹅副粘病毒均未成功扩增;对DHV-I临床病料进行RT-PCR检测,检测结果与病毒分离结果一致.结果表明,建立的DHV-I的RT-PCR技术具有快速、特异、灵敏的特点. 相似文献
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为建立可同时鉴别检测鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的基因序列,分别设计3对特异性引物,通过三重RT-PCR扩增条件优化、敏感性和特异性试验,建立了鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR方法。使用该方法对同一样品中的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均得到与试验设计相符的202bp(鸭Ⅰ型肝炎病毒),351bp(鸭圆环病毒)和474bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对小鸭温病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测到1pg的鸭Ⅰ型肝炎病毒RNA、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA。建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒感染的检测。 相似文献
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为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×10~1拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。 相似文献
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根据GenBank中登录的猪轮状病毒(PoRV)VP6基因序列特征,设计特异性的引物和探针,条件优化后,建立检测PoRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明:建立的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,最低可检测192拷贝·μL~(-1);特异性强,对猪常见病原(如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒等)检测均为阴性;重复性好,扩增相关系数为0.999,其组内和组间变异系数分别为0.25%~1.26%和0.31%~1.49%.对临床收集的79份猪腹泻病料进行常规RT-PCR检测,检测出阳性样品4份,阳性率为5.06%(4/79);对这79份病料进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测,检测出阳性样品6份,阳性率为7.59%(6/79);同时,4份经RT-PCR检测为阳性的样品经TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测均为阳性,符合率达100%.本研究建立的方法为PoRV早期感染诊断提供检测手段. 相似文献
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为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线.结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异.可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点. 相似文献
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SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：1
为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。 相似文献
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【目的】研究新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）弱毒S株C30在雏番鸭血液中的病毒血症，口咽、泄殖腔的排毒规律及靶器官的带毒时间，了解弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律和致弱机理。【方法】设计特异性引物，建立检测NDRV核酸的RT-qPCR方法；新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株第30代（NDRV-S-C30）腿部肌肉注射2日龄雏番鸭，在免疫后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d(Days post vaccination,dpv)采集其血液、肝脏、脾脏、泄殖腔分泌液和口咽液，用RT-qPCR方法检测NDRV在血液、口咽、泄殖腔及靶器官的增殖能力及带毒时间。【结果】建立了检测NDRV核酸的特异性RT-qPCR方法，使用该方法检测NDRV弱毒攻毒雏鸭的口咽和泄殖腔排毒时间分别为2～8 d和2～10 d，排毒高峰期为4～6 d；病毒血症时间为1～4 d，其中1～2 d为病毒血症高峰期；弱毒在肝脏的带毒时间为3～6 d，在脾脏的带毒时间为1～8 d。【结论】NDRV-S-C30弱毒株免疫雏番鸭后可通过口腔和泄殖腔向外界排毒，仅能引起较弱的病毒血症反应，且在肝脏中的增... 相似文献
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鹅星状病毒(GAstV)是近年临床新发病原,也是导致当前雏鹅痛风致死的主要病因,研究显示该病毒存在两种不同基因型。为建立快速准确的核酸鉴别诊断方法,本研究针对不同基因型GAstV保守域RNA依赖性RNA聚合酶序列各设计1对特异性引物,建立以RNA为模板的双重一步法RT-PCR检测方法。条件优化试验结果显示,双重RT-PCR方法彼此无干扰;引物特异性强,对坦布苏病毒、鹅细小病毒、呼肠孤病毒、鸭瘟病毒的检测均为阴性;体系中引物适宜浓度为1 μmol,退火温度范围广,50~54 ℃皆可;敏感性高,最低检测限分别为103拷贝数和102拷贝数。对采集自江浙地区的73份样品进行检测,结果显示,鹅星状病毒阳性率为93.2%,主要为Ⅱ型星状病毒的单一感染(阳性率86.3%),部分样品呈现两种类型星状病毒混合感染现象(阳性率6.8%)。上述结果表明本研究建立的双重RT-PCR方法可用于GAstV的鉴别诊断和分子流行病学调查。 相似文献
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《江苏农业学报》2017,(6)
为实现番鸭呼肠孤病毒的快速检测,本研究根据Gen Bank中公布的番鸭呼肠孤病毒σC蛋白基因的高度保守序列设计了4条引物,通过优化反应体系中各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。然后以鸭常见病毒基因组为模板,开展特异性检测,最后通过添加SYBR Green I荧光染料完成可视化LAMP检测方法的建立。结果显示:25μl LAMP反应体系,镁离子5×10-5mmol,d NTP 1.25×10-5mmol,Bst DNA聚合酶8 U,F3/B3 5×10-6μmol,FIP/BIP 3×10-5μmol,62℃,45 min为最优反应条件;在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;对临床样品的阳性检出率与常规RT-PCR检测方法一致,但灵敏度高于PCR方法,最低检测限为10 pg,检测结果可直接通过肉眼观察来判断。该方法为番鸭呼肠孤病毒的可视化RT-LAMP快速检测试剂盒研制奠定了基础。 相似文献
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为建立一种能快速、简便、灵敏地检测人双埃克病毒(Human Parechovirus,HPeV)SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank发表的人双埃克病毒8个基因型的参考毒株全序列,针对5′端非编码区保守序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增此靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,经过优化反应条件,建立标准曲线和融解曲线,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价;检测临床粪便样品共156份,并与常规套式RT-PCR检测结果进行比较。结果显示,建立的标准曲线Ct值与模板浓度呈现良好的线性关系(r2=0.999),融解曲线特异,检测灵敏度可达60拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍,重复性变异系数小(<1%),能特异地检测HPeV。临床样本检测结果也表明该法(检出30份)灵敏度高于套式RT-PCR(检出21份)。实验结果证明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望成为HPeVs的分子诊断、流行病学调查等相关研究的工具。 相似文献