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为了建立一种快速、准确能早期检测草鱼肠炎病原菌的方法,以患病草鱼为材料,制备点状产气单胞菌单克隆抗体(McAb),并鉴定其特异性和抗原表位;采用过碘酸钠方法,以辣根过氧化物酶标记单抗,用试管凝集试验测定其活性;建立点状产气单胞菌McAb的双抗原夹心ELISA检测方法,确定包被单抗和酶标单抗的浓度,并测定其灵敏度和特异性。结果:1)获得了2株特异性强和抗原表位不同的单抗,其ELISA效价为1∶16 000。2)辣根过氧化物酶标记的抗体活性为1∶640。3)建立了包被抗体稀释度为1∶800、酶标抗体稀释度为1∶1 600的双抗原夹心ELISA检测方法,该方法与点状产气单胞菌呈强阳性反应,与近似菌无交叉反应,灵敏性为7×103cfu/mL。结论:制备的点状产气单胞菌McAb的效价高、特异性强;建立的双抗原夹心ELISA方法操作简单、灵敏度高、特异性强,可应用于草鱼肠炎病原体的早期快速检测。 相似文献
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[目的]探索间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA法测定大型溞ChE和NAGase的试验条件及方法灵敏度。[方法]分别采用间接竞争和间接非竞争ELISA方法测定大型溞ChE和NAGase。[结果]对于ChE,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为1.466μg/m L和1∶10 000,灵敏度为7.426 7 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为5.277μg/m L和1∶8 000,灵敏度为0.163 4 ng/m L。对于NAGase,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为8.961μg/m L和1∶6 000,灵敏度为4.199 9 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为6.450μg/m L和1∶4 000,灵敏度为0.250 8 ng/m L。[结论]无论是ChE还是NAGase,间接竞争ELISA在最适抗体浓度下的检测灵敏度均高于间接非竞争ELISA,加之其操作简便,间接竞争ELISA在生物和环境样品ChE和NAGase含量检测中值得推广应用。 相似文献
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【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15min。7S抗原蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间25min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好,灵敏度较高。【结论】建立了仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法,该法具有很强的特异性和敏感性,可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。 相似文献
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牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。 相似文献
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本文利用终浓度为0.5%(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig G作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法。此检测方法的抗原最适包被浓度为1×10~7 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1∶100(v/v),二抗最适工作浓度为1∶2 000(v/v),最低检测限为1×10~4 CFU/mL。利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80%,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应。 相似文献
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抗副溶血弧菌IgY的提纯及检测副溶血弧菌的间接ELISA的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
分离纯化抗副溶血弧菌IgY,并建立一种快速检测副溶血弧菌的间接酶联免疫吸附法(indirect ELISA),分析了该方法的敏感性、特异性和重复性. 将水稀释法、乙醇沉淀法和DEAE-Sepharose FF离子交换层析联用以分离纯化抗副溶血弧菌IgY,然后以纯化的IgY为一抗,辣根过氧化物酶标兔抗鸡IgY为二抗,建立检测副溶血弧菌的间接ELISA方法. 结果表明:建立的间接ELISA方法,一抗的最佳工作质量浓度为15 μg/mL,二抗的最佳稀释度为1∶ 10 000,副溶血弧菌培养液的检出限为1.0×105 cfu/mL,该方法对测定的其他8种菌株没有交叉反应. 建立的间接ELISA方法具有良好的灵敏度、特异性和稳定性,能够快速、准确地对副溶血弧菌进行检测. 相似文献
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黄海希瓦氏菌单抗介导间接ELISA快速检测技术的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
应用农业部海洋水产增养殖学重点实验室制备的特异性抗黄海希瓦氏菌Shewanella smarisflavi AP629单克隆抗体3D9作为一抗,以碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠Ig作为酶标二抗,建立了仿刺参Apostichopusjaponicus＂化皮病＂病原菌——黄海希瓦氏菌AP629的间接ELISA快速检测方法,并进行了条件优化。结果表明：抗原的最佳包被浓度为107个/mL,一抗工作的最佳稀释度为1∶32,病原菌的检测灵敏度为5×105个/mL。该方法特异性强,与希瓦氏菌属其它种类、弧菌和气单胞菌等均无交叉反应。该方法的建立有助于快速准确地诊断由黄海希瓦氏菌AP629引起的仿刺参疾病。 相似文献
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采用辛酸硫酸铵法从温氏附红细胞体高免血清中提取IgG,过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶,建立了检测温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA.结果显示:抗体最佳包被量为156μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为6.64μg/mL,抗原及酶标抗体的最佳作用时间分别为1 h.应用建立的检测方法对河北省内222份奶牛血样进行了检测,阳性检出率为91.0%.证实:该方法灵敏度高,简便快速,适合作群体检测. 相似文献
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以针对血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体为捕获抗体,纯化的抗血卵涡鞭虫的兔抗血清为检测抗体,初步建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定确定最佳反应条件：包被的单克隆抗体浓度为10μg/mL,多抗兔血清工作浓度为14.3μg/mL,待检样品稀释度为1：800;HRP-羊抗鼠IgG按1∶20 000稀释。用建立的ELISA方法对86份已知背景样品进行检测,阳性检出为97.6%,血卵涡鞭虫抗原检测的灵敏度为100 pg/mL;与蟹血淋巴细胞、假丝酵母菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等样本均无交叉反应。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于诊断梭子蟹乳化病血卵涡鞭虫病的检测。 相似文献
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应用新城疫单抗酶联试剂对一群发生疑似新城疫的绿孔雀群进行快速诊断,采用肛门泄殖腔棉拭取样方法对病孔雀取样,应用双单抗夹心ＥＬＩＳＡ试验检出多数病死孔雀新城疫强毒抗原阳性,诊断该群绿孔雀发生了新城疫。用流行病学调查、临床症状观察、病理剖检、病毒分离、鉴定和毒力试验的经典诊断方法及新城疫疫苗紧急防疫效果观察验证表明,新城疫单抗酶联试剂盒诊断孔雀新城疫简便、快速、准确。 相似文献
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【目的】克隆牛筋草(Eleusine indica)中草甘膦的靶标基因EPSPS,获得牛筋草EPSPS重组蛋白并制备其单克隆及多克隆抗体,组装酶联免疫试剂盒,检测牛筋草植株不同组织EPSPS的表达水平及蛋白含量,为快速鉴定抗性牛筋草提供简便工具。【方法】利用PCR方法克隆EPSPS基因全长;构建pET30a-EPSPS阳性质粒并转化宿主菌BL21,经IPTG诱导表达后获得重组蛋白;利用该重组蛋白免疫小鼠与新西兰大白兔,制备单克隆及多克隆抗体,并利用Western blot检测特异性;利用间接ELISA方法进行免疫配对试验,筛选出最佳配对抗体,优选各试剂工作浓度并组装试剂盒;用研制的试剂盒对不同种群牛筋草进行EPSPS含量检测,并与qPCR结果分析比较。【结果】牛筋草EPSPS的开放阅读框含有1 620 bp的核苷酸,编码540个氨基酸,理论等电点为8.80,该蛋白无跨膜区域。进化树分析结果表明牛筋草EPSPS与水稻EPSPS进化关系最近。诱导蛋白表达的培养条件为1 mmol·L-1的IPTG,25℃,获得了纯度大于90%,浓度为3 mg·m L-1 相似文献
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[目的]建立快速、有效检测农产品中玉米赤霉醇(ZER)残留量的方法。[方法]试验以人工合成的ZER为包被原,ZER为竞争半抗原,两者与一定量的抗玉米赤霉醇单克隆抗体反应,应用间接竞争ELISA法建立玉米赤霉醇单克隆抗体快速检测农产品中ZER含量的半定量检测,同时对该ELISA试剂盒进行了调试。[结果]试验建立检测ZER的ELISA方法,其最适包被浓度为1∶5 000,抗体最适工作浓度为1∶2 500,酶标二抗的最适工作浓度为1∶5 000。试剂盒检测限为0.5 ng/ml,添加回收率在70.0%~116.0%,变异系数小于20%,在2~8℃条件下可保存90 d。[结论]该试验建立的方法可应用于玉米、小麦、高粱等中的玉米赤霉醇的检测,应用前景广阔。 相似文献
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为建立特异性好、敏感性高、稳定可靠的兔支气管败血波氏杆菌(Bb)双夹心ELISA检测方法,制备了兔抗Bb免疫血清和小鼠抗Bb腹水单抗(Bb McAb),并将它们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感性试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并与PCR检测方法比较。结果表明,兔抗Bb IgG的最佳稀释度为1∶6 400,浓度为2.5 mg/L;单抗的最佳稀释度为1∶800,浓度为5.0 mg/L。特异性试验和重复性试验结果表明,该方法特异性强、重复性好,与兔常见病菌大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌和产气荚膜梭菌均不发生反应,同时与PCR检测方法的符合率为100%。 相似文献
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应用新城疫单抗酶联诊断试剂盒对３群发生疑似新城疫的鸡群进行了快速诊断。采用肛门泄殖腔棉拭取样方法取样，分别取６０、３５和３８份样品，应用双单抗夹心ＥＬＩＳＡ试验检测出新城疫强毒抗原阳性分别为５、３和２份样品，诊断该３群发生非典型鸡新城疫。用病毒分离、鉴定和毒力试验的经典诊断方法验证表明，新城疫单抗酶联试剂盒诊断非典型新城疫简便、快速、准确 相似文献
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采用抗猪囊尾蚴头节蛋白单克隆抗体包被ELISA板,以兔抗猪囊尾蚴头节蛋白多抗作为捕获抗体,建立了猪囊尾蚴头节双抗体夹心ELISA检测方法,用该方法分别检测猪囊尾蚴、棘球蚴和猪蛔虫具有良好的特异性。用ELISA和RT-PCR同时检测120份样品,ELISA的特异性和敏感性分别为98.1％和80.0％,2种方法的符合率为95.8％。
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【目的】建立诺氟沙星（norfloxacin,Nor）免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒（Nor-kit）,并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50 为5.18 μg•L-1,灵敏度为0.31 μg•L-1,检测限为1.00 μg•L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异系数也小于10%;在4℃保存条件下,试剂盒可以保存6个月而质量不变。奶样添加回收试验,试剂盒与LC-MS/MS测定结果没有显著差异（P≥0.05）;而且检测实际生产中鲜奶样时,试剂盒与LC-MS/MS测定结果也无显著差异（P≥0.05）。【结论】本研究成功研制出灵敏、特异、简便的诺氟沙星残留检测ELISA试剂盒。 相似文献
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基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。 相似文献