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原生质体的制备是真菌遗传转化的基础,为了解芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi的遗传转化体系,以芦笋茎枯病菌Pa1100为供试菌株,研究了细胞壁裂解酶、酶解时间、稳渗剂等对芦笋茎枯病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明可制备芦笋茎枯病菌原生质体较为适宜的条件是：CM液体培养基中培养分生孢子3 d,以1.5%裂解酶、1%崩溃酶和1.5%蜗牛酶为组合酶解液,33 ℃水浴酶解4.5 h,以PBS（pH 6.98）与1 mol/L MgSO4混合液为酶解稳渗剂。含0.6 mol/L蔗糖的PDA培养基较适合于芦笋茎枯病菌原生质体的再生。 相似文献
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由共享镰刀菌Fusarium commune引起的莲腐败病是我国莲生产上的主要病害之一。本研究以强致病力菌株FCN23为供试菌株,通过PEG介导的遗传转化法研究了菌龄、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响。结果表明,分生孢子在YPD液体培养基培养24 h获得新鲜菌丝,在酶解时间为2.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaCl溶液时原生质体制备效率最高。进而将遗传霉素的抗性基因和绿色荧光蛋白基因转入莲腐败病菌原生质体中,获得了稳定表达的转化子,能够稳定遗传gfp基因,说明莲腐败病菌的遗传转化体系构建成功。该体系的建立为莲腐败病菌的侵染过程及基因功能研究奠定了基础。 相似文献
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禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)是引起我国小麦纹枯病的主要致病菌。为了建立高效稳定的禾谷丝核菌遗传转化体系,本试验比较研究了不同细胞壁降解酶、酶液浓度、酶处理温度和时间等因素对禾谷丝核菌原生质体制备的影响,利用正交设计试验优化了原生质体再生条件。结果表明,液体培养6d的菌丝,采用15mg/mL溶壁酶+10mg/mL蜗牛酶组成的混合酶液,30℃下酶解4h,可以获得较高的原生质体释放量,可达到3.0×106个/mL;禾谷丝核菌原生质体再生的最佳条件是以SuTC缓冲液作为渗透压稳定剂悬浮原生质体,采用单层混菌法接种于TB3再生培养基,原生质体再生率可达到58.6%。禾谷丝核菌原生质体制备和原生质体再生条件的优化,为深入研究禾谷丝核菌生长发育的分子遗传学基础和进一步探索小麦纹枯病的致病机理奠定了基础。 相似文献
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以优化原生质体的制备方法,建立小麦光腥黑粉菌的遗传转化体系为目的,研究了小麦光腥黑粉菌菌株培养时间、细胞壁裂解酶、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响。结果表明,以水琼脂培养基上培养7d的菌丝为初始材料,配置1.5%崩溃酶+1.5%溶壁酶+1.5%蜗牛酶的复合酶液,28℃酶解2 h后原生质体的获得率最高;以1.2 mol/L的氯化钾为渗透压稳定剂,得到的原生质体数量最多,且释放的原生质体能够均匀散乱分布,不聚集成堆;较适宜原生质体再生的培养基为TB3培养基,可产生较多的单菌落。 相似文献
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为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl2介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。 相似文献
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由链格孢(Alternaria alternata)引起的梨黑斑病是我国梨生产上的主要病害之一,导致梨叶与果实产生黑斑症状及早期落叶,对我国梨产业的健康发展构成严重威胁。本实验在前期获得强致病性梨黑斑病菌菌株HN-5基础上,建立该病菌的遗传转化体系。通过优化原生质体制备过程以及转化体系发现梨黑斑病菌HN-5原生质体制备的最优条件为:菌丝在M R液体培养基中培养36 h;以0.7 M NaCl+0.8 M Mannitol为稳渗剂,配置复合细胞壁裂解酶(1%崩溃酶+1%裂解酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶),酶解菌丝3 h,原生质体的产量可达0.5×10~7个·mL~(-1)。通过PEG介导的原生质体遗传转化体系,将含有RFP基因的质粒p KD7转入链格孢菌HN-5中,转化效率为6个·μg~(-1)DNA。PCR检测和转化子荧光观察均表明RFP基因整合到了HN-5基因组中并成功表达。致病性分析发现RFP (Red Fluorescent Protein)标记转化子致病性未发生变化。本研究成功建立了PEG (Polyethylene glycol)介导的梨黑斑病菌遗传转化体系,构建了RFP标记菌株,为研究该病菌的致病机理奠定基础。 相似文献
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为探索快速、稳定、高效的葡萄溃疡病菌转化子致病力评价方法,分别采用无伤接种、昆虫针针刺接种、打孔器打孔接种等3种接种方法,将随机选取的来自葡萄溃疡病菌REMI转化子库的50株转化子分别接种‘富士’苹果果实和‘夏黑’葡萄一年生绿枝条,测量病斑大小.结果表明,用葡萄绿枝条接种能区分不同转化子的致病力,而苹果果实则仅能将致病力减弱的转化子筛选出来.在葡萄绿枝条上致病力减弱的转化子有96.15％在‘富士’苹果果实上的致病力也是减弱的,而用苹果果实接种未筛选到致病力增强转化子.上述结果为获得致病力突变体奠定了基础. 相似文献
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苏云金芽胞杆菌B7发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫致死率高达85.06%;枯草芽胞杆菌TL2对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有显著拮抗活性(对峙培养5 d对病原菌的平均抑制率在60%以上)。本文对菌株B7和TL2的原生质体形成、完全灭活及融合的最佳条件分别进行了筛选,研究结果表明菌株B7在溶菌酶1.0 mg/m L、酶解70 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为85.0%和29.41%;菌株TL2在溶菌酶1.25 mg/m L、酶解50 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为80.00%和25.00%。菌株TL2原生质体完全灭活的最佳条件为60℃水浴35 min,菌株B7原生质体完全灭活的最佳条件为紫外照射25 min。灭活后的两亲本融合最佳条件为30℃水浴融合20 min后涂布再生培养基,用影印法连续传代10次以上,最后筛选出17株稳定的融合子,经过杀虫防病检测最后筛选到一株兼具两亲本特性的高效融合子TLB15。TLB15发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫校正死亡率为93.44%,TLB15发酵液对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病(对峙培养5 d)的平均抑制率分别为60.00%和62.79%。 相似文献
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研究了多种细胞壁降解酶的种类和浓度、酶解时间、菌龄,以及渗透压稳定剂等因素对粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成和再生的影响。结果表明,粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成的适宜条件为:使用溶壁酶(3mg/ml)、蜗牛酶(3mg/ml)、纤维素酶(2mg/ml)的组合酶液酶解时间为2h,菌龄为14h,稳渗剂为NaCl(0·5mol/ml)。在上述条件下,原生质体产量达到9·25×106/ml。将原生质体涂布于含KCl(0·5mol/ml)的再生培养基上,再生率最高。显微观察表明,粉红粘帚霉67-1菌株主要通过顶端和侧位释放原生质体。 相似文献
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Botryosphaeria dieback is one of the important grapevine trunk diseases in the world. In this study, two grapevine trunk disease samples were collected from two grape vineyards in Miyun District of Beijing, where grapevine trunk disease was very severe. The potential pathogens were isolated, purified and identified. Meanwhile this study conducted to evaluate the pathogenicity by Koch’s Postulate, and the effects of temperature and light on the growth of pathogens. According to morphological characteristics and a multi-gene phylogenetic analysis with sequences of ITS, EF-1α and TUB, four isolates were identified as Lasiodiplodia citricola, which was the causal organism of grapevine Botryosphaeria dieback. Moreover, the pathogen was able to grow between 10-40 ℃. The optimum temperature for mycelial growth was 30 ℃, and it grew rapidly under full light. This is the first report of grapevine Botryosphaeria dieback disease on grapes caused by L. citricola in China. 相似文献
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由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的苹果轮纹病是影响我国苹果安全生产的重大病害之一。因此,本研究基于受苹果轮纹菌侵染的苹果组织中果胶裂解酶基因Bdpl1表达上调这一现象,通过Split-marker PCR技术构建Bdpl1基因敲除载体,并通过PEG介导的原生质体转化获得转化子,经常规PCR和qRT-PCR对所获得的转化子进行筛选,成功获得1个Bdpl1基因缺失阳性突变子。该转化子在PDA上的培养基性状与野生型没有明显差异,但在果胶培养基上菌落直径明显小于野生型。其胞外果胶酶活相比野生型明显下降,但在离体“早富”苹果枝条上的致病力并没有明显的下降。通过qRT-PCR技术发现在基因Bdpl1敲除后,其家族内有3个基因在病菌侵染过程中相比野生型明显上调表达(>3倍)。这些现象表明果胶裂解酶基因Bdpl1与病原菌的营养生长过程关系不大,但其参与对寄主果胶类物质的降解。Bdpl1基因对轮纹病菌致病力的影响较小,有可能是Bdpl1基因敲除后,该基因家族内其他基因的上调表达补偿了Bdpl1基因的功能。 相似文献
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苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)是一种寄主十分广泛的进境植物检疫性真菌,在我国尚无分布。近年来,我国口岸多次截获该病菌。为更好地实现对该病菌的针对性检疫防控,本研究采用DIVA-GIS软件对该病菌在我国的潜在适生区进行了预测,并对其适生区内寄主情况进行了深入分析。研究结果表明,苹果壳色单隔孢溃疡病菌在我国的适生区域较为广泛,主要分布在我国华东、华北和华中地区;该病菌在其适生区域内存在大量寄主,尤其是水果类作物,林木寄主也有较多分布。因此,该病菌一旦传入我国,极可能造成十分严重的经济损失,值得高度警惕。本文最后提出了针对苹果壳色单隔孢溃疡病菌的风险防控建议。 相似文献
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原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。 相似文献
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引起玉米纹枯病的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)多为多核杂核真菌,也难以通过有性态使其细胞核进行单一化。利用原生质体再生的方法对单核玉米纹枯病菌JN的细胞核进行同核纯化,比较从单个原生质体再生菌获得的rDNA\|ITS序列,发现序列间存在差异,说明其细胞核没有达到预期纯化的效果。继而扩增了双核和多核玉米纹枯病菌的rDNA\|ITS序列,发现它们自身的rDNA\|ITS序列也存在差异,因此认为立枯丝核菌的这种rDNA\|ITS序列的差异可能是长期未经过有性阶段的结果且与其细胞核数目无关。使用转化丝状真菌的载体转化纹枯菌未获得稳定的转化子,进而对载体进行了改造,用纹枯菌(AG\|3)actin基因的启动子和终止子控制潮霉素基因构建了载体pRsA。利用PEG介导的原生质体转化方法,实现了对单核纹枯菌的转化,PCR验证得到3个转化子。但在PDA培养基连续继代5代后,转化子的潮霉素抗性消失。结果对改进纹枯菌的转化方法有借鉴意义。 相似文献