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提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作为模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出了0.55kb的I型菌毛结构基因(piliA)。将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因。经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549bp,但其中O1菌株I型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入。经DNAStar核酸分析软件分析,此3菌株的I型菌毛基因的同源性为89.9%~92%。 相似文献
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提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作为模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出了0.55kb的Ⅰ型菌毛结构基因(piliA).将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因.经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549 bp,但其中O1菌株Ⅰ型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入.经DNA Star核酸分析软件分析,此3菌株的Ⅰ型菌毛基因的同源性为89.9%～92%. 相似文献
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提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1，O2和O78的基因组DNA作为模板，用TD－PCR技术从其中分别扩增出了0．55kb的I型菌毛细菌基因（piliA)，将扩增得到的piliA基因片段，TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中，转化至受体菌JM109中，用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法，得到含阳性重组子的菌株，提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定，结果证实，所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因，经DNA序列分析，其结果基因阅读框架大小为549bp，但其中O1菌株I型菌毛基因在第72位发生突变，有6个碱基插入，经DNA Star核酸分析软件分析，此3菌株的I型菌毛基因的同源性为89．9％－92％。 相似文献
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3株致病性鸡大肠杆菌P型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
用鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA做为模板，PCR分别扩增出了0．55kb的P型菌毛结构基因(papA)。将扩增得到的3个papA基因片段分别克隆进pGEM—T栽体中，转化至受体菌JM109中，用Amp／IPTG／X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法，得到含阳性重组子的菌株，提取质粒后用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切进行鉴定。所得阳性重组子进行DNA序列测定，测序结果经DNA Star核酸分析软件包分析比较，结果表明，所构建的克隆质粒中均含有相应完整papA基因，其开放式阅读框架大小为549bp，编码182个氨基酸。此3株菌的P型菌毛结构基因的同源性为98.9％～100％，其中O1株和O78株的P型菌毛基因的ORF序列100％相同，O2株有2个碱基与前两者不同。 相似文献
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用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78,分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段,再将载体pET-28a(+)用SacI和BamHI双酶切,最后将pET-28a(+)DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接,转化至受体菌BL21(DE3)中,经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78.重组菌株BL21(DE3) (pETFimO1)、BL21(DE3)(pETFimO2)和BL21(DE3)(pETFimO78)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白. 相似文献
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用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78，分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段，再将载体pET-28a( )用SacI和BamHI双酶切，最后将pET-28a( )DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78。重组菌株BL21（DE3），（pETFimO1)、BL21（DE3）（pETFimO2)和BL21（DE3）（pETFimO78)经IPTG诱导后，其表达产物经SDS－PAGE检测，结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌I型菌毛蛋白。 相似文献
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禽源和猪源大肠杆菌1型菌毛主要亚单位抗原多样性分子基础的初步研究 总被引：2，自引：0，他引：2
从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107/86分离株分别提取基因组DNA,并以此为聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的模板,扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA,得到了大小约570bp的扩增产物,将此扩增产物克隆于T载体,通过内切酶酶切分析得到4个阳性重组质粒;对上述4个大肠杆菌分离株的pilA基因进行序列测定,通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现:3个禽源株间FimA的同源性为94.3%至99.0%;禽源株和猪源株间FimA的同源性为89.6%至91.1%。在pilA开放性阅读框所编码的FimA182个氨基酸序列中,禽源大肠杆菌O78血清型的2个分离株037株和166株间只有2个氨基酸不同,其同源性为99.0%。 相似文献
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根据Genebank中已登录的大肠杆菌O157:H7菌株EDL933基因序列中茵毛分子伴侣ycbR基因序列设计1对引物,并分别在其5'端分别加入Neo I、Xho I酶切位点,以大肠杆菌O157:H7国内分离株97094的DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出710 bp的DNA片段.回收并纯化该DNA片段,用限制性核酸内切酶Nco I、Xho I同时消化DNA片段和双酶切栽体质粒pET28a(+).将它们回收纯化并连接,然后转化到宿主菌大肠杆菌DH5a,从该菌中提取重组质粒,用PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定,表明ycbR基因定向克隆到了载体质粒pET28a(+).再将重组质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),在含Kan抗生素LB培养基中经IPTG诱导12～16 h,做SDS-PAGE分析,表明ycbR基因在菌株中获得高效表达,表达蛋白相对分子质量大小约为30 000,与预期结果一致.为研究大肠杆菌ycbR基因产物的功能和致病作用奠定了基础. 相似文献
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犬α干扰素的克隆、表达及纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
根据DDBJ/GenBank基因库中已登录的犬α干扰素序列,设计了含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采取聚合酶链式反应(PCR)技术以犬基因组DNA为模板进行了CaIFN-α的成熟肽基因的克隆,扩增产物与克隆载体pGEM-T Easy Vector连接后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定和EcoRⅠ酶切鉴定,初步证实为CaIFN-α,用SphⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将目的片段与表达载体pQE30连接,然后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定、SphⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、序列测定证实已经成功克隆了CaIFN-α,构建了重组表达质粒PQE30/CaIFN-α。将重组表达菌液培养至OD600为0.5时加入IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析CaIFN-α在大肠杆菌中得到了表达,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,表达量约占细菌总量的20%左右。将诱导表达的菌液经超声裂解、变性、复性、透析后,得较纯的CaIFN-α蛋白。本研究为以后CaIFN-α的活性及临床应用研究奠定了基础。 相似文献
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猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。 相似文献
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为了鉴定犬源贾第虫佛山分离株的基因型,根据GenBank中登录的贾第虫β-贾第素(bg)基因序列(X85958),设计2对引物GF1/GR、GF2/GR,采用套式PCR方法从贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段;将扩增产物纯化并连接到质粒载体pMD18-T,克隆转入感受态细胞JM109,挑选阳性克隆测序,然后进行序列分析。结果显示,犬源贾第虫bg序列长为384 bp,与预期目的片段一致;分子进化树表明该犬源贾第虫分离株为蓝氏贾第虫D型。该基因型在我国为首次报道,为贾第虫的分子鉴定以及分子遗传学研究奠定了基础。 相似文献
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青海血蜱cDNA表达文库的免疫学筛选和阳性克隆的鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
为获得抗青海血蜱免疫原基因，用免抗青海血蜱差异蛋白阳性血清和兔抗青海血蜱唾液蛋白阳性血清对青海血蜱cDNA表达文库进行了免疫学筛选，经过初筛和复筛共获得58个阳性信号。用所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25．8使之自动亚克隆为重组质粒，用此亚克隆质粒转化宿主菌JM109并从中提取重组质粒进行PCR、酶切和测序分析。序列分析表明：共获得新cDNA序列21个。将前5个cDNA登录GenBank／ncbi，获取登录号。所获阳性克隆为青海血蜱保护性抗原的筛选奠定了基础。 相似文献
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禽传染性支气管炎病毒S1基因玉米表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
禽传染性支气管炎病毒主要编码3种结构蛋白,其中S蛋白的S1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜有关.本研究选取具有代表性的禽传染性支气管炎病毒分离株SAIB14和SAIB4,以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板,用具有高保真度的pfu酶分别扩增,得到含先导序列的S1基因片段.把扩增产物分别通过ClaⅠ和BamHⅠ酶切纯化,替换中间载体pUGFPocs的GFPm1基因,构建中间表达载本pUSAIB14和pUSAIB4.用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4,回收Ubi-S1-Tocs片段,定向插入到pCAMBIA 300载体的多克隆位点.经酶切和PCR鉴定,证明获得了S1基因的玉米表达载体pCUSAIB14和pCUSAIB4.外源基因导入受体植物能否有效表达,表达载体构建是关键因素,构建时选用表达载体的类型、启动子和终止子、目的基因插入位点等都有影响.本研究用BarHⅠ和ClaⅠ双酶切载体pUGFPocs,用S1基因扩增片段替换GFPm1基因,将S1基因置于Ubi启动子和T-ocs终止子的控制之下,有助于S1蛋白的高效表达,最后将Ubi-S1-Tocs单元HindⅢ和KpnⅠ双酶切下来,插入到pCAMBIA1300的多克隆位点,得到可用于农杆菌介导的转化或直接转化的植物表达载体pCUSAIB4和pCUSAIB14. Ubi启动子来自玉米,属组成型启动子,内含有一个内含子和外显子,是已知的最强的单子叶植物启动子,外源基因在Ubi启动子的控制下,在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达.pCAMBIA1300是中国农业科学院作物遗传育种中心构建的植物表达载体,可用于农杆菌介导的转化或直接转化,载体中T-DNA左右边界内带有多克隆位点和筛选标记Hyg基因,Hyg基因是玉米和水稻转化试验中广泛使用的标记基因,编码潮霉素磷酸转移酶,适于玉米和水稻转化后用化学试剂潮霉素进行筛选转化体.多克隆位点处可插入外源基因,在农杆菌介导的转化中,由于卸甲载体的作用,植物表达载体T-DNA左右边界内的序列,包括外源基因和筛选标记基因部分,发生转移并进入植物细胞内,用筛选试剂潮霉素可有效筛选出整合有外源基因的转化体.转基因植物疫苗生产技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达重组蛋白的一类生物技术.与常规疫苗及其它新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,由于其应用前景可观,已引起免疫学家、分子生物学家和植物学家的极大兴趣与关注.利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、痢疾抗原等10多种疫苗,国内在利用转基因植物生产疫苗的研究方面还远远滞后于其他国家.本研究利用含先导序列的禽传染性支气管炎病毒S1基因,构建了玉米表达载体系统,为进一步在玉米中表达IBV S1基因提供了基础材料. 相似文献
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猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
根据已发表的PRVgD、gE基因序列 ,设计合成了两对引物 ,对猪伪狂犬病病毒XIN W株相关的毒力基因gD、gE序列进行测定和分析。经PCR扩增分别得到了全长为 12 0 9bp,1 743bp的gD、gE全基因序列 ,将它们克隆到pGEM T Easy载体中 ,并转化JM1 0 9,挑取阳性菌落的质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,与其他参考毒株的gD、gE基因进行比较。结果表明 ,XIN W株与其它毒株相比 ,gD、gE基因核苷酸序列的同源性分别为 97.9%～99.3 % ,98.0 %～ 98.7% ;氨基酸序列的同源性分别为 97.0 %～ 99.3 % ,97.1 %～ 98.1 %。不同的PRV毒株间gD、gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平高度保守。遗传进化树显示 ,XIN W株和国内其它毒株起源相同 ,属同一进化分支 相似文献
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我国部分地区禽致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 总被引：15，自引：2，他引：15
从山东、河南、江苏、辽宁、河北、广西等10余个省、市、自治区临诊上有典型大肠杆菌病病变的病禽2000多只采集病料，分离培养和鉴定出504株大肠杆菌。其中126株，经O血清型鉴定，除18株未能定型，7株自凝外，共鉴定出101个分离株的O血清型，这些分离株覆盖了31个血清型，但以O78、O2、O45、O109、O18、O8/O93、O107、O53、O154等10个血清型为主，共53株，占定型菌株的52．3％，前5种血清型在种类上只占定型菌株血清型的总数的16．1％，却拥有38个分离株，占定型菌株的37．6％。因此，可以认定O2、O78、O45、O109、O18等5个血清型为优势血清型。另外，融合株6个，占定型菌株5．9％，其中，O1／O154、O2／O86、O8／O93、O2／O78、O107／O154、O53／O80、O35／O107/O154、O4／O18／O142等为首次分离报道。药敏试验结果表明：82％的菌株对丁胺卡那霉素高敏，65％的菌株对头孢氨苄高敏，63％的菌株对壮观霉素高敏，50％的菌株对左旋氧氟沙星高敏，38％的菌株对新霉素和庆大霉素高敏。 相似文献
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荧光定量PCR检测牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测牛乳中金黄色葡萄球菌(S.aureus)肠毒素A基因(SEA)定性定量的检测方法,本研究针对S.aureus SEA基因片段设计1对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-time PCR检测方法.结果显示,特异性产物Tm值为78.2℃～78.5℃,最低可检测到49.5 fg/μL(16.5拷贝)的阳性质粒.标准曲线的相关系数为0.99.与其他常见的产SEB的S.aureus、产SEC的S.aureus、无乳链球菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌DH5 α及JM109均无交叉反应.该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为牛乳中S.aureus的快速检测提供了新的技术手段. 相似文献