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1.
为了探讨小鼠MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）为成肌细胞的可能性,本研究用小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表达载体质粒转染绵羊UCMSCs,在观察细胞形态变化的同时,检测成肌细胞标记蛋白表达、表达成肌细胞特异蛋白的细胞比率和成肌细胞特异基因mRNA相对表达量。结果显示,与对照组（未转染）相比,在转染MyoD-pcDNA3.1质粒后第21天,大部分细胞呈现似成肌细胞的细长管状;与对照组未表达相关蛋白相比,转染MyoD-pcDNA3.1后第8天,在荧光倒置显微镜下观察到细胞表达MyoD和Desmin蛋白荧光,转染后第16天,不仅观察到细胞表达MyoD和Desmin,而且观察到MyoG蛋白的表达;对于转染细胞后22 d的细胞进行流式细胞仪检测显示,表达MyoD、MyoG和Desmin的细胞比率分别达93.5%、97.4%和99.5%;此外,实时荧光定量PCR检测显示,转染MyoD-pcDNA3.1后第28天,其细胞中的MyoD、MyoG和Desmin mRNA相对表达量分别提高2.046、2.389和5.489倍。上述结果表明,利用小鼠MyoD构建真核表达载体具有诱导UCMSCs分化为成肌细胞的功效。 相似文献
2.
为了确定猪速激肽3基因(tachykinin3,TAC3)核心启动子区域,探索作用于该区域的转录因子对TAC3的调控作用,以猪耳组织DNA为模板,PCR扩增TAC3基因5'端不同长度缺失片段,并构建至p GL3-basic载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过双荧光素酶活性分析确定核心启动子区域,染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)验证转录因子与基因启动子区的作用,构建转录因子超表达载体和小干扰RNA(siRNA)转染至猪卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测TAC3基因mRNA表达变化。结果显示:成功构建了TAC3基因5'端不同长度缺失片段,通过双荧光素酶报告系统分析发现,-1 310/-544区域为TAC3基因的核心启动子区,-2 486/-1 633区域可能存在负向调控元件,-1 310/-544区域可能存在正向调控元件。Ch IP检测发现转录因子C/EBPβ和YY1分别结合在TAC3基因的-653/-639和-873/-856区域;超表达C/EBPβ和YY1后,TAC3基因启动子活性显著升高(P0.05)、mRNA表达水平显著上调(P0.01);干扰C/EBPβ后,TAC3基因mRNA表达水平显著下调(P0.01);干扰YY1后,TAC3基因启动子活性显著降低(P0.05)。结果表明:转录因子C/EBPβ、YY1结合在TAC3基因的核心启动子区域,促进TAC3基因的转录活性。 相似文献
3.
旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制。本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF4（-521～-503 bp）、USF （-379～-370 bp）和E2（-296～-281 bp）进行定点突变并构建突变报告基因载体,在C2C12细胞系内初步鉴定MyoG基因核心转录调控因子。最后,采集70日龄泰州鹅胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、肾和下丘脑组织样,利用荧光定量PCR检测MyoG基因和核心转录调控因子的组织表达谱。结果表明,扩增得到的鹅MyoG基因5'侧翼区序列包含启动子元件;利用双荧光素酶报告载体检测到鹅MyoG基因启动子区-624～-154 bp区域存在关键顺式调控元件;结合定点突变技术初步鉴定USF是鹅MyoG基因核心转录调控元件。组织表达谱研究进一步表明,MyoG和USF基因在鹅8个不同组织中均有表达,且在胸肌、腿肌和心组织中共同高表达（P<0.01）。鹅MyoG基因5'侧翼区具有启动子转录活性,-624～＋37 bp是核心启动子区,USF是MyoG核心转录调控因子。试验结果为探究MyoG基因在鹅肌肉发育过程的调控机制提供理论依据。 相似文献
4.
绵羊高硫角蛋白启动子表达活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
角蛋白是羊毛主要结构蛋白,为了筛选在绵羊毛囊中具有高表达活性高硫角蛋白的内源启动子,本研究以绵羊基因组为模板,克隆得到高硫角蛋白基因启动子B2C,将B2C与去除CMV启动子的pAcGFP1-N1载体连接,构建了重组真核表达载体。采用阳离子脂质体法转染传代培养的绵羊成纤维细胞和去除透明带的小鼠4细胞期胚,分析其表达活性。结果表明,转染后48 h,在蓝光激发条件下可以检测到绵羊成纤维细胞核内及核周围绿色荧光蛋白的高表达,转染72 h后,在核内表达减弱,而细胞质内表达增加;此外,虽然利用病毒启动子构建的GFP表达载体能够在小鼠的早期胚胎细胞中表达,但由B2C启动子与GFP构建的表达载体转染小鼠早期胚胎后,未观察到绿色荧光,表明B2C启动子在绵羊成纤维细胞中具有表达活性,但不能在小鼠早期胚胎中表达。 相似文献
5.
利用PCR方法从猪基因组DNA中扩增了1.2 kb的肌肉生长抑制素(myostatin)基因启动子序列。并进一步以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建了真核表达载体MSTNPro-EGFP;通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞和猪成纤维细胞,对猪myostatin基因启动子的转录调控活性进行鉴定。结果表明:猪myostatin基因启动子可以启动GFP在C2C12细胞中的转录和表达,而将猪MSTNPro-EGFP载体转染猪胎儿成纤维细胞后并未观察到GFP的表达,说明myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性。 相似文献
6.
旨在研究奶牛乳腺上皮细胞中固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)对固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)调控的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)表达的影响。培养奶牛乳腺上皮细胞,在细胞中转染奶牛SCD基因启动子载体,同时转染SREBP1和SCAP真核表达载体作为处理,采用双荧光素酶报告基因系统检测转染SREBP1和SCAP对SCD基因启动子活性的影响;采用免疫荧光技术观察SREBP1在细胞核的表达,采用荧光定量PCR检测SCD基因mRNA的表达。结果表明,与转染pcDNA3.1载体的对照组相比,转染SCAP对SCD启动子活性无显著影响;转染SREBP1和共转染SCAP/SREBP1极显著增加SCD基因启动子活性值(P0.01),并且SCAP的转染剂量与SCD的启动子活性值之间具有极显著的量效关系(P0.01);在乳腺上皮细胞中转染SCAP后,能够增强SREBP1在细胞核的表达;细胞转染SREBP1和共转染SCAP/SREBP1后,SCD基因mRNA的表达分别显著上调1.23倍和1.54倍(P0.05)。本研究表明,奶牛SCAP可以增加SREBP1蛋白在细胞核中的表达,促进对SCD基因的转录激活作用。 相似文献
7.
8.
为探讨水牛SOX2基因的转录调控机制,本试验克隆获得其长2555 bp 的5'调控序列片段,结合生物信息分析设计了-2263、-1816、-1275、-660和-407 bp 5个缺失体,并分别构建其EGFP表达报告载体,通过生产转基因早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析各缺失体片段的转录活性。结果发现,除-407 bp以外的各缺失体在猪4.5 d早期胚胎细胞中均能成功启动下游EGFP的表达,且随着片段缩短,其转录活性呈极显著递减趋势(P<0.01);而转染水牛成纤维细胞48 h后,除p-407-EGFP以外的各缺失体报告载体转染组均观察到少数细胞发光,转录活性两两之间差异均极显著(P<0.01),转录活性从高到底排布分别为-2263、-660、-1275和-1816 bp。p-407-EGFP载体在胚胎水平和细胞水平均未观察到荧光。以上结果表明,-660~-407 bp是构成水牛SOX2基因表达不可缺失的部分,-2263~-1816 bp中有非多能细胞特异性的增强子元件存在,而-1816~-1275 bp和-1275~-660 bp均含有多能性细胞特异性的增强子元件。 相似文献
9.
旨在解析牛MSTN启动子与MEF2C之间的相互调控作用,进一步探讨MSTN基因在肉牛肌肉生长发育方面的调控机制。首先,通过PCR扩增关岭牛MSTN启动子序列2 267 bp和MEF2C基因CDS区1 425 bp。其次,构建pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C双荧光素酶报告载体,采用脂质体法共转染至小鼠C2C12成肌细胞,24 h后检测其双荧光素酶活性。最后,通过PCR扩增MSTN启动子核心片段MSTN-P1,重新构建以MSTN-P1片段替代(CMV)区的重组表达载体pEGFP-N3-MSTN-P1-MEF2C,将其分别转染至小鼠C2C12成肌细胞和大鼠下颌腺上皮细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白发光情况,48 h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR检测MEF2C基因在不同细胞中的表达情况。结果显示,在小鼠C2C12成肌细胞中,共转染pcDNA3.1(+)-MEF2C试验组较pGL3-Basic-MSTN试验组能显著增强MSTN启动子的活性(P0.05),较pGL3-Basic对照组能极显著增强MSTN启动子的活性(P0.01);MSTN启动子核心片段MSTN-P1能驱动MEF2C基因在小鼠C2C12成肌细胞中的表达量极显著上调(P0.01),且能驱动MEF2C基因在大鼠下颌腺上皮细胞中的表达量显著上调(P0.05)。结果表明,在转录水平,MSTN启动子与MEF2C可能同时参与了牛肌肉生长和分化的调控。 相似文献
10.
《畜牧与兽医》2015,(6):54-59
利用在线预测软件对牛C4A基因的5'侧翼区序列进行生物信息学分析,成功构建了一系列表达载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析牛C4A基因的5'侧翼区启动活性。分别通过定点突变技术构建突变质粒,研究调控C4基本表达和诱导表达的转录因子结合位点。利用EMSA技术验证转录因子在研究细胞系中存在与否。结果显示,C4A基因启动子序列转录起始位点上游169 bp为报告基因荧光值最高的片段,即为启动子核心区;其中SP1(-169~-158)、E-box(-122~-117)和AP-1(-80~-71)是调控C4基本表达的主要转录因子结合位点,且3个转录因子在Hep G2细胞系中真实存在。 相似文献
11.
本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料. 相似文献
12.
构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。 相似文献
13.
本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402~-249bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334~+1bp区域的启动子活性最强,-402~+1bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334~-971bp、-587~-147bp区域存在正调控元件,-1 976~-1 334bp、-971~-587bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强cMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。 相似文献
14.
通过构建猪核转录因子C/EBPβ编码区真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,将猪C/EBPβ异位表达于小鼠成肌细胞C2C12细胞中,为进一步研究C/EBPβ在猪脂肪发育中的调控机制奠定基础。本试验利用RT-PCR扩增C/EBPβ编码区序列并测序,提交GenBank;并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过双酶切和测序鉴定重组质粒。将重组表达体pEGFP-N1-C/EBPβ导入C2C12细胞,荧光显微镜下观察C/EBPβ在细胞中的定位,半定量RT-PCR和Western blot检测C/EBPβ在细胞中的表达情况。本试验成功克隆测序了猪C/EBPβ基因编码区序列,并首次上传到GenBank;成功构建猪C/EBPβ真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,并将其异位表达。结果表明:猪C/EBPβ在脂肪组织中表达量丰富,心肌和背最长肌表达微量,并且正确插入真核表达载体pEGFP-N1,荧光显微镜下观察重组体组主要集中在细胞核;而C/EBPβ基因和蛋白在转染重组体C2C12细胞中均有表达。本研究为提高猪肉肌内脂肪含量方面的研究提供新的思路。 相似文献
15.
《畜牧兽医学报》2015,(9)
本研究旨在克隆绵羊CYP19基因卵巢启动子序列片段,构建真核表达载体,并在细胞水平检测其组织特异性表达情况。参考已知序列设计特异性引物,PCR扩增绵羊CYP19基因卵巢启动子1.1和0.5kb两个片段,并与已公布的序列进行同源性比较;将测序正确的两个片段分别定向克隆到去除CMV的pEGFP-N2载体骨架中,构建真核表达载体pCYP19-1.1-EGFP-N2和pCYP19-0.5-EGFP-N2,重组质粒在脂质体LipofectamineTMLTX+PLUS介导下,分别转染绵羊的颗粒细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后24、48和72h观察EGFP表达情况。结果表明,扩增获得片段与已公布序列高度同源;应用转录因子结合位点预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TATA-box核心启动顺式元件,并含有多个潜在转录因子的结合位点。转染24h后,发现pCYP19-1.1-EGFP-N2在颗粒细胞可观测到绿色荧光表达,48h荧光细胞数量有所增加;转染72h时荧光细胞数最多;在胎儿成纤维细胞也有少量EGFP基因表达。pCYP19-0.5-EGFP-N2在颗粒细胞和成纤维细胞中均未检测到荧光。结果表明,扩增所得的绵羊CYP19基因卵巢启动子1.1kb片段可引导外源基因在颗粒细胞中的表达,可用于与繁殖相关的基因功能及转基因动物研究,但并非卵巢特异性启动子。 相似文献
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为探讨水牛OCT4基因的表达调控模式,本研究扩增克隆了水牛OCT4基因5'调控序列片段,并设计了-2 571 bp、-2 389 bp、-2 338 bp和-2 191 bp 4个不同长度的调控序列片段,分别构建了EGFP表达报告载体.通过生产转基因猪早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析了不同长度调控序列片段的转录活性.结果发现,在猪4.5d胚胎中各调控序列均能成功启动下游EGFP表达,但转染水牛胎儿成纤维细胞48 h后均表观察到荧光.QRT-PCR分析显示,-2 571 bp片段在4.5d猪胚胎细胞中的转录活性极显著高于其他调控序列(P＜0.01),-2 389 hp与-2 338 bp之间差异不显著(P＞0.05),二者均极显著高于-2 191 bp(P＜0.01).上述结果表明水牛源OCT4基因5 '调控序列在猪早期胚胎中具有转录活性,且翻译起始位点上游2 191 bp片段足以介导OCT4在多能性细胞中的特异性表达；-2 389～-2 338 bp片段上游的CR4亦参与了猪4.5d胚胎中OCT4基因的转录调控. 相似文献
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为了研究绵羊Musclin对糖代谢和胰岛素作用的影响,本试验运用生物信息学软件对其结构特征进行预测,并构建绵羊Musclin基因真核表达载体。分4组对绵羊胎儿成肌细胞进行处理：空载体组（pcDNA3.1）、Musclin过表达组（pcDNA3.1-Musclin）、空载体+胰岛素组（pcDNA3.1+Insulin）、Musclin过表达+胰岛素组（pcDNA3.1-Musclin+Insulin）。然后分别在分化48和72 h时收集细胞,检测Musclin对正常或添加胰岛素培养的分化状态绵羊肌细胞糖代谢的影响,并利用荧光定量PCR检测相关基因表达的变化。酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了表达载体pcDNA3.1-Musclin。生物信息学分析表明,绵羊Musclin蛋白含有一个信号肽,并在28氨基酸位点处存在一个酶切位点。亚细胞定位在胞外,属于分泌蛋白。其二级和三级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。细胞试验表明,绵羊Musclin基因过表达明显减少了正常或胰岛素处理的绵羊肌细胞糖原含量并增加了培养液中葡萄糖含量。诱导分化72 h时,过表达Musclin抑制了Musclin过表达组和Musclin过表达+胰岛素组绵羊肌细胞中IRS1、AKT1、AKT2、GLUT1、GLUT4基因mRNA表达,并促进了GSK3β mRNA表达;而诱导分化48 h时,只有GLUT4基因的表达受到抑制。综上所述,绵羊Musclin基因过表达可以影响肌细胞糖代谢并减弱胰岛素的作用,二者相互协调以维持糖代谢稳态。其作用机制涉及到上述相关基因的表达变化,且与绵羊成肌细胞的分化状态有关。 相似文献
18.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(15)
为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(12):1982-1988
为了获得绵羊MSTN基因敲低成纤维细胞株,克隆获得MSTN基因序列构建其真核表达载体;设计合成并筛选3种MSTN基因干涉序列(M1、M2和M3),构建相应的3种RNA干涉载体;将MSTN基因真核表达载体单独或分别与3种RNA干涉载体共转染绵羊成纤维细胞后,分别检测其对MSTN基因表达的干涉效率以获得最佳的MSTN基因RNA干涉载体;将筛选的RNA干涉载体线性化后转染绵羊成纤维细胞,通过筛选获得转基因细胞株。结果显示,成功克隆得到与GenBank中序列同源性为100%的绵羊MSTN基因序列,并获得真核表达载体pcDNA3.1(+)-MSTN;构建获得MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3;与单独转染pcDNA3.1(+)-MSTN后293GP细胞中MSTN基因的相对表达量相比,转染干涉载体后MSTN基因相对表达量明显下降,其中pRNAT-M1干涉效率最佳;将pRNAT-M1线性化后转染绵羊成纤维细胞并利用G418筛选获得转基因阳性细胞;获得的转基因阳性细胞的细胞形态、生物学特性均呈现正常;PCR检测结果显示,pRNAT-M1已整合到细胞基因组中。上述结果表明,成功获得了MSTN基因敲低的绵羊成纤维细胞株。 相似文献
20.
为了分析绵羊清道夫受体MARCO基因的启动子序列特点,初步研究其功能及转录调控机理,以绵羊肺组织DNA为模板,通过PCR扩增绵羊MARCO基因启动子序列,对其序列进行生物信息学分析,并构建双荧光素酶报告基因载体。结果显示,成功克隆绵羊MARCO基因启动子,大小为1 002 bp;预测了其核心活性区域,发现有1个潜在的活性区域位于5′端-790～-741,同时发现了1个TATA-box元件和多个转录因子结合位点,未发现CpG岛。结果表明,位于绵羊MARCO基因启动子区域的TATA-box元件和Sp1、NF-1、NF-κB、C/EBPalp、c-Jun等转录因子,可能影响绵羊MARCO基因启动子的激活,为后续研究MARCO基因的转录调控机理提供了参考依据。 相似文献