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《中国兽医学报》2018,(12)
大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌是引起毛皮动物肺炎的最为常见的细菌性病原。本研究选择3种细菌的特异性基因,分别为phoA(大肠杆菌)、plcH(铜绿假单胞菌)和khe(克雷伯菌)基因,进行多重PCR方法的建立,预期扩增目的条带大小分别为720,199,428bp。通过反应条件的优化,选择退火温度54.5℃,引物体积(按照phoA、plcH和khe顺序,浓度10μmol/L)为0.50,0.75,2.00μL。敏感性试验结果显示,大肠杆菌和肺炎克雷伯菌最低检测DNA质量浓度为1mg/L (1μL),而铜绿假单胞菌的最低检测质量浓度为100μg/L (1μL)。利用建立的多重PCR方法对临床样品进行检测,结果表明该方法能够有效检测出3种病原菌。 相似文献
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兔源肺炎克雷伯氏菌重组酶聚合酶扩增检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种检测兔源肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)重组酶聚合酶扩增方法(recombinase polymerase amplification,RPA),根据肺炎克雷伯氏菌的phoE基因保守序列设计引物,扩增片段大小为277 bp,并对反应条件进一步优化,最终建立了适宜于快速准确检测兔源肺炎克雷伯氏菌的重组酶聚合酶等温扩增方法。该方法可特异性检测出兔源肺炎克雷伯氏菌,最低检出细菌量为8.3×10~1 CFU/mL,灵敏度比传统PCR高100倍。本研究建立的肺炎克雷伯氏菌RPA检测方法特异性强、操作简单,从而为生产中的兔源肺炎克雷伯氏菌现场快速检测提供了一种新方法。 相似文献
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依据Gen Bank中大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的部分已知序列,选取大肠杆菌的uid A基因、肺炎克雷伯氏菌的khe基因和不动杆菌的sec E基因,利用Primer Premier 5设计引物,选出扩增序列的3对引物及相应的Taqman探针,uidA、khe、secE探针5'端分别标记FAM、HEX、CY5荧光发射基因,3'端标记BHQ1淬灭荧光基因。通过优化反应条件,建立一种同时检测大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的诊断方法。特异性和敏感性试验显示,该方法能特异地检测大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌,其最低检测限分别为2×10~(-1) CFU/μL、9.2×10~(-1) CFU/μL和4.3×10~(-1) CFU/μL。整个检测扩增在2小时内完成。该结果表明本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的灵敏度、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测三种病原菌。 相似文献
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为建立特异性强且敏感性高的兔源F型多杀性巴氏杆菌(Pm)快速检测方法，本实验根据F型Pm fcbD基因的保守序列设计特异性引物和探针，经反应条件优化，建立了检测兔源F型Pm的荧光定量PCR方法。利用该方法检测兔源F型Pm、兔源A和D型Pm、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌等临床常见兔源病原菌，结果显示，该方法仅对兔源F型Pm检测为阳性，其余病原菌均为阴性，特异性强。利用该方法分别检测10倍倍比稀释(1×108拷贝/μL～1×100拷贝/μL)的兔源F型Pm基因组DNA，进行敏感性试验，结果显示该方法的检测限为10拷贝/μL，敏感性分别是已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的100倍和10倍，敏感性高。利用该方法对不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内和批间变异系数均小于3%，重复性好。利用该方法检测64份已知结果的临床样品，结果显示该方法的检测结果与已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法检测结果的符合率均为100%，准确性高。本研究首次以fcbD为靶基因建立兔源F型Pm的荧... 相似文献
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为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法，本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，设计2对特异性引物，经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV，并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示，该方法的最适退火温度为59℃，扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL (10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示，除Pm和RHDV有特异性扩增条带外，其余相关病原均无扩增条带，特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板，经该双重PCR方法扩增。结果显示，该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL，对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL，敏感性较高；对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致，重复性较好。对100份临床... 相似文献
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《中国畜牧兽医》2018,(11)
本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物(1对内引物、1对外引物),进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料(dNTPs)、内外引物比例、Mg~(2+)浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。 相似文献
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本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域，设计2对引物（1对内引物、1对外引物），进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg2+浓度、反应时间和温度进行优化和选择，并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明，通过优化试验，筛选到最优反应体系和反应条件；应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验，特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL，比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测，检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增，灵敏性更高，反应时间更短，检测成本更低。 相似文献
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本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法.根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验.结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368 bp.最佳退火温度在56~59 ℃之间,引物浓度均为0.2 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Mg2+浓度为2.5 mmol/L.3种细菌间无交叉反应.对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应.最低能同时检测到10-5 ng/μL的细菌基因组DNA.3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好.同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出.结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持. 相似文献
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以鸡毒支原体pvpA基因序列建立的套式PCR检测方法 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验以GenBank中登录的鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的特异性黏附蛋白pvpA基因序列为目标,用两对引物对鸡毒支原体DNA进行套式PCR扩增,建立套式PCR扩增体系,并进行了套式PCR的敏感性和特异性试验。结果显示,应用该PCR方法对MG DNA的检出限为0.18 pg/μL;以鸡常见细菌、病毒DNA为模板进行PCR扩增,均未扩增出条带,说明该方法特异性强,适用于临床对MG早期感染的检测。 相似文献
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为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个方面优化了反应条件,并检测了该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增出了铜绿假单胞菌1 400 bp的flgE特异性基因片段,最佳退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度分别为56℃、30个循环、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特异性试验表明,仅铜绿假单胞菌中可扩增出目的片段,而多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均未扩增出相应片段。敏感性试验结果表明,本方法可检测到最低10 pg/μL的铜绿假单胞菌基因组DNA以及100 CFU/mL的病原菌。 相似文献
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为了研究快速检测布鲁菌的通用PCR体系,试验从GenBank数据库中查到布鲁菌的基因组序列(登录号为JF918757),并选取布鲁菌膜外蛋白BSCP31基因的特异性保守区段,设计了1对PCR引物,对PCR扩增条件进行优化。结果表明:能够扩增出牛种、羊种、猪种布鲁菌模板DNA的384 bp目的基因片段,而对大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌均呈阴性,最低检出浓度为1.5 pg/μL,对同批和不同批的菌株进行6次PCR扩增,重复性和稳定性较好。说明试验所建立的布鲁菌PCR检测方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性。 相似文献
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根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌和腐败梭菌的α毒素基因序列,分别设计并合成针对2种α毒素基因的特异性引物,通过扩增条件的优化,建立快速鉴别产气荚膜梭菌和腐败梭菌的双重PCR方法。特异性试验显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌则均未能扩增出相应条带。灵敏度试验结果显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌基因组DNA最低检测量分别为17.95pg/μL和1.261pg/μL。应用该方法对样品进行检测,其中5份为产气荚膜梭菌阳性。成功建立了特异性强、敏感性高的双重PCR方法,可以有效进行产气荚膜梭菌和腐败梭菌的快速鉴别,对羊梭菌病病原快速鉴定及流行病学调查具有重要意义。 相似文献
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《动物医学进展》2020,(6)
为建立一种能同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的双重PCR方法,根据MG gapA基因和MS vlhA基因设计合成特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立能够同时检测MG和MS的双重PCR方法。结果显示,双重PCR反应条件中最适退火温度为58℃,反应体系中最适模板浓度为5.76ng/μL,最适引物量为1.25μL(10mmol/L)。特异性试验显示,所建PCR方法对MG、MS、MG/MS混合培养物均可扩增出相应的特异性条带,而对AIV疫苗、NDV疫苗、MO、E.coli、SE的基因组扩增结果均为阴性;敏感性试验显示,该方法对MS、MG最低检出核酸终浓度分别为0.045ng/μL和0.09ng/μL;临床应用性试验显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG和MS核酸。结果表明,该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、临床应用性,可以用于临床病料中MG和MS的快速检测,为MG和MS感染的诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法。 相似文献
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为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH2O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1 000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。 相似文献
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肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛主要结构亚单位基因为靶序列,设计合成了1对可扩增长609 bp目的片段的引物,建立检测肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因的PcR方法.特异性试验表明,本室保存的表达Ⅲ型菌毛的鸡源肺炎克雷伯菌临床分离株Kpn7扩增出609 bp的特征性片段,而大肠埃希菌、副伤寒沙门菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和金黄色葡萄球菌扩增产物均未检出;敏感性试验表明,PER方法检测该菌基因组DNA的灵敏度为16.8 ng/L,检测该菌菌液的灵敏度为3.7× 102 CFU/mL.用此方法对10份临床疑似病例分离物进行检测,结果有5株阳性.表明此方法特异性和敏感性都很高,可用于临床Ⅲ型菌毛肺炎克雷伯菌病的辅助诊断和流行病学调查. 相似文献
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应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎 总被引：1，自引：1，他引：1
根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp:该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10-7μg/mL,是单一PCR的103倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。 相似文献
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干肉制品中霉菌PCR鉴定方法的建立 《畜牧与饲料科学》2016,37(3):49-49
为了早期预防传统牛肉干发生霉变,建立了牛肉干中真菌PCR的鉴定方法,在特异性和敏感性方面对所建立的PCR方法进行了验证。其中特异性试验以霉变的鲜牛肉、酵母菌、乳酸球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌为材料进行验证;敏感性试验以霉变的鲜牛肉为材料,提取其DNA并将其稀释成不同的浓度进行PCR验证。结果显示：特异性试验中仅霉菌样品在约300 bp处出现特异性条带,而其他样品在该处无特异性条带出现,表明具有良好的特异性;敏感性试验中,霉菌DNA原液、10倍稀释、100倍稀释、1 000倍稀释时均出现了约300 bp的特异性条带,即霉菌DNA模板稀释度为1 000倍（2 ng/μL）时仍对引物有敏感性。该试验为市场传统牛肉干真菌PCR检测工作提供了依据。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2019,(5)
本研究根据鼠疫耶尔森氏菌caf1及YPO0392基因,设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,构建一体系的检测体系,对其敏感性、特异性和稳定性进行评价,并对8份鼠疫阳性及24份阴性DNA样本进行应用评价。结果显示,一体系双重检测鼠疫DNA的敏感度为17.93×10-5 ng/μL;19份鼠疫菌DNA都有扩增,25份非鼠疫菌DNA都未扩增;对8份阳性现场DNA样本进行检测,一体系检测结果均为阳性;对24份阴性DNA样本进行检测,结果均为阴性。结果表明,本研究成功建立了可同时检测鼠疫耶尔森氏菌caf1和YPO0392基因的一体系双重荧光定量PCR方法,具有良好的敏感性与特异性,操作方便并节约成本,能够代替单基因检测方法。 相似文献
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为建立绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的双重PCR检测方法,本试验分别设计了绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的特异性引物,优化反应条件后对其特异性和敏感性进行评价,并对40份鼻拭子进行了检测。结果显示,该方法能同时扩增出绵羊肺炎支原体545 bp和精氨酸支原体806 bp的特异性片段,而对其他病原的DNA扩增均为阴性。该双重PCR方法对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的最低检测限分别为100和10 pg/μL。40份鼻拭子检测结果显示,双重PCR检测方法与分离培养法符合率高达92.5%,均能鉴定出绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体。结果表明,本研究建立的双重PCR方法可用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的临床快速诊断。 相似文献