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采用RT-PCR方法从猪肾脏皮质组织中扩增出pEGF基因，将其连接到克隆载体pMD18-T上，经测序鉴定正确后，再克隆到原核表达载体pET-41a（＋）上，构建重组表达质粒pET-EGF．用重组质粒转化Ecoli BL21（DE3）宿主菌，经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳和Western-blotting对GST—EGF融合蛋白进行分析，结果表明37℃诱导表达的融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的20．2％；30℃诱导表达的可溶性融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的7．7％． 相似文献
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为获得牛生长激素（BST）蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达．先设计2对引物,从pUCm—T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体（pET30a和pET29a）,转化E．coli DH5a并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E．coli BL21（DE3）和RosettaTM（DE3）pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达．结果表明,重组表达载体pET30a—BST和pET29a—BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21（DE3）为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30a—BST／Rosetta^TM和pET29a．BST／Rosetta^TM分别可见分子量约29．5,26．5kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26％,35％．说明稀有密码子限制BST基因在E．coli中的表达。选择适宜的宿主菌可克服此障碍． 相似文献
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根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献
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几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞壁的主要成分,几丁质酶通过破坏细胞新物质的沉积,激发寄主植物的抗病反应,使病原真菌细胞壁中的几丁质降解。植物几丁质酶具有广泛的生理活性。几丁质的酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一。本研究通过几丁质酶基因的克隆,构建原核表达载体pET-28a（＋）-GchiI,利用IPTG诱导表达,经PAGE分析表明,该基因表达的蛋白分子量为34kD左右,其表达产物主要以包涵体的形式存在。抑茵圈试验发现,IPTG浓度为0．6mmol／L时抑茵效果最佳。本研究对利用基因工程技术培育抗病作物品种,提高作物抗病性具有重要参考价值。 相似文献
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构建了T7启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1的原核表达载体pET-EuCHIT1和pMCSG-EuCHIT1,其表达产物分别含6个组氨酸(6His)标签和6个组氨酸连接的麦芽糖结合蛋白(his6-tag–maltose-binding protein,MBP)标签,分别将重组载体遗传转化大肠杆菌细胞BL21(DE3),在37℃、150 rpm条件下培养至菌液OD值为0.4~0.8后,转到16℃、150 rpm条件下以1 m MIPTG诱导培养12 h,表达产物经SDS-PAGE分析,p ET-EuCHIT1/BL21(DE3)表达以包涵体形式存在36.03 kD融合蛋白,pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)成功表达可溶形式存在的77.21 kD融合蛋白。故可以使用pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)获得可溶的融合蛋白,为之后的EuCHIT1的多克隆抗体的制备和及功能研究奠定基础。 相似文献
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采用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒（AIV）广东株的血凝素基因HA．将HA基因克隆到笔者所设计的原核表达载体pMBX上，成功构建重组表达质粒pMBX-HA．将其转化到E.coli BL-21感受态细胞中表达，经SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为96200的融合蛋白，表达产物占菌体总蛋白的29．5％．经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表达的．Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H9N2 AIV阳性血清具有良好的免疫反应性．将可溶表达的融合蛋白用体积分数为50％的Ni-NTA树脂过柱纯化，用融合蛋白作抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出禽流感阳性血清． 相似文献
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目的构建人癌症/睾丸相关蛋白XAGE-1b原核表达载体及诱导XAGE-1融合蛋白表达。方法从文库质粒pACT2-XAGE-1b中利用PCR法扩增XAGE-b cDNA编码序列,将其克隆到pET-32a载体中,并将重组质粒pET-32bXAGE-1b转染大肠杆菌DE3中,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测融合蛋白表达。结果原核表达载体pET-32a-XAGE-1b构建成功;转染菌株经IPTG诱导后,出现约29 kD蛋白过表达,Western-blot检测显示His6融合蛋白表达。结论成功构建原核表达载体pET-32a-XAGE-1b,转染菌株可表达His6融合蛋白。 相似文献
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【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫BJ株TA4基因的表达及电泳分析 总被引：2，自引：1，他引：2
球虫子孢子表面抗原TA4(25kD)是通过二硫键连接8和17kD 2条多肤形成的,在孢子化后期合成。E.tenella BJ株的TA4基因同国外株的同源性为99％。本试验进行了TA4基因的原核融合表达,并对表达蛋白的SDS-PAGE电泳特性进行探究。试验发现,以pGEX-KG为载体,用IPTG可诱导TA4基因在E.coli BL21(DE3)中的表达。SDS-PAGE表明,融合蛋白大小约43 kD,而非推测的51 kD,诱导6 h的蛋白表达量即可达到较高水平,表达量约为31％。采用抗GST抗体进行Weste 相似文献
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蝗虫微孢子虫与绿僵菌协调使用对东亚飞蝗的毒力测定 总被引：1，自引：0，他引：1
以东亚飞蝗三龄蝗蝻为试虫,室内生物测定蝗虫微孢子虫与绿僵菌对试虫的毒力,并研究了这两种病原物以5种比例联合使用的各方面效果。结果表明,蝗虫微孢子虫与绿僵菌对东亚飞蝗LD50分别是7.72×104个/g和5.04×105个/g。两者联合使用增效显著,其中绿僵菌与微孢子虫以1∶1比例处理试虫,饲养24d的LD50（2.5×104个/g）和LD90（1.99×106个/g）均较其他比例最小,效果最佳。比较7个不同剂量处理组的致死时间,LT50从小到大为2∶1,16∶1,1∶1,1∶2,0∶1,1∶0,1∶29;LT90从小到大为2∶1,1∶1,1∶2,16∶1,1∶0,0∶1,1∶29,若同时考虑接种剂量大小,则1∶1处理组致死时间相对最佳。比较6组处理的存活试虫的蝗虫微孢子虫感染情况,各组存活试虫仍可达到较高感染率,联合使用两种病原物在统计学生对微孢子虫感染情况无显著影响。综合各方面因素,当接种剂量绿僵菌∶蝗虫微孢子虫为1∶1时,达到防治东亚飞蝗的最佳实验室配比。 相似文献
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应用绿僵菌防治马尾松毛虫初探 总被引：18，自引：4，他引：18
绿僵菌在室内对马尾松毛虫3～4龄幼虫的毒力与白僵菌相当，其LD50＝7．95×107个／L，LT50＝6．61～13．08天（孢子数在1．0×1011～1．0×107个／L）．本文还比较了绿僵菌和白僵菌在不同温度、湿度下的分生孢子萌发率．实验结果表明，绿僵菌在防治马尾松毛虫上具有较大的开发应用价值． 相似文献
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唐诺德·罗伯茨 《安徽农业大学学报》2007,34(2):141-148
The Mormon cricket (MC),Anabrus simplex (Orthoptera:Tettigoniidae),has a long and negative history with agriculture in the western states of the USA where MC often migrates in large groups and causes significant damage to forage plants and cultivated crops.In this review, virulence to MC of isolates of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae varieties acridum and anisopliae were compared in an effort to identify isolates with promise for use as MC biological control agents.All of the isolates tested induced 100% or nearly 100% mortality by six days post application of the fungal conidia.Searches for new Metarhizium isolates with high heat and UV-B tolerance included isolation fungi from field-caught MC and grasshopper after they died in the laboratory and culturing fungi from soil samples collected from numerous western USA sites.The survey was preceded by development of a dodine based selective medium that,at 0.002% active ingredient,permitted growth of M.anisopliae var.acridum,but inhibited most contaminating fungi.The M.anisopliae var.acridum isolates examined to date have much higher tolerance to heat and UV-B irradiation than M.anisopliae var.anisopliae isolates,and this may be critical to successful field applications.The variety acridum has not yet been found in the USA,so our search for such isolates continues.Several new M.anisopliae var.anisopliae and Beauveria spp.were found,and the Metarhizium isolates are being characterized as to stress tolerance and virulence to insects.Characterization includes comparisons of new and pre-existing Metarhizium isolates by amplified fragment-length polymorphism (AFLP) analysis.Finally, experiments on MC developmental biology were conducted to gather data needed to develop a degree day model and to establish laboratory colonies of MC. 相似文献
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化学杀虫剂对绿僵菌的影响及菌药混用研究 总被引：10，自引：1，他引：10
研究 6种化学杀虫剂对金龟子绿僵菌分生孢子萌发的影响 ,结果表明 6种化学杀虫剂皆对绿僵菌分生孢子有程度不同的抑制作用 ,浓度愈高 ,抑制作用愈强 ,但氧化乐果对绿僵菌孢子萌发抑制作用最小 .对马尾松毛虫的生物测定结果表明 :绿僵菌 (含孢量为 1 .9× 1 0 10个· L-1)与敌杀死 ( 1∶ 60 0 0 0 ) ,辛硫磷 ( 1∶ 1 0 0 0 0 ) ,灭杀毙 ( 1∶ 2 5 0 0 0 )和灭幼脲 ( 1∶ 1 5 0 0 0 )混用有明显的增效作用 ,其 LT50 值比单用绿僵菌 (含孢量为 1 .9× 1 0 10个· L-1)分别提前了 7、6、5和 3d 相似文献
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研究了几种化学杀虫剂对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)胞外蛋白酶和几丁质酶活性的影响。结果表明,化学杀虫剂对绿僵菌的胞外蛋白酶和几丁质酶活性影响较大,供试的12株金龟子绿僵菌大部分菌株的胞外蛋白酶和几丁质酶活性均明显降低,仅有Ma202、Ma207菌株的胞外蛋白酶和几丁质酶活性略有提高。 相似文献
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