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1.
猪细环病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测猪细环病毒1型和2型,根据猪细环病毒的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。选择猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性;用质粒标准品进行TTSuV1和TTSuV2的PCR-DHPLC检测,灵敏度可达1.0×101拷贝·μL-1。对80份血清样本分别应用实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法及本文所建立的PCR-DHPLC法与进行检测,发现TTSuV1有63份PCR-DHPLC阳性,63份实时荧光PCR阳性,54份PCR-凝胶电泳阳性;TTSuV2有69份PCR-DHPLC阳性,69份实时荧光PCR阳性,56份PCR-凝胶电泳阳性。本试验建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。 相似文献
2.
为建立一种敏感、自动化,高通量的检测病料中鹅细小病毒（GPV）的PCR-DHPLC检测方法,本研究首先根据GenBank上GPV标准毒株VP3基因序列设计一对引物,建立检测GPV的PCR方法,然后将PCR检测方法与DHPLC法进行有机结合,建立了GPV PCR-DHPLC检测方法。以GPV、鹅副粘病毒、鸭瘟病毒及正常番鸭胚尿囊液进行特异性试验,结果无交叉反应,表明该检测方法具有较高的特异性。对GPV阳性样品检测结果表明该方法的敏感性较高,是常规PCR电泳法的100倍,且具有较好的重复性。对临床上采集的100份疑似病料,分别应用PCR电泳法和本试验建立的PCR-DHPLC方法进行检测,结果阳性符合率为100%。表明该方法具有特异、敏感、快速、重复性好、可高通量检测等优点,可用于临床样品的大批量检测。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2016,(8)
为建立检测东方马脑脊髓炎病毒(EEEV)的方法,本研究利用PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),针对EEEV NS1基因,设计特异性引物,通过优化反应条件,对核酸扩增产物采用DHPLC进行检测分析,核酸扩增产物形成DHPLC特征峰图,建立了EEEV的PCR-DHPLC快速检测方法。结果显示该方法与其他6种常见马病病毒均无交叉反应,未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰,具有较强的特异性;对梯度稀释的标准阳性模板的检测限可达到10拷贝/μL;利用本研究建立的方法与荧光定量RT-PCR对30份临床样品进行检测,两者符合率达100%。本研究建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可以用于EEE的病原学诊断及流行病学调查。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2017,(6):999-1006
为了实现猪细环病毒(TTSuV)快速检测,给TTSuV的调查、监测和防控提供可行性、操作性强的技术支持。本试验根据TTSuV的序列特点设计特异性引物、探针,应用实时荧光PCR技术检测TTSuV1a型和TTSuV1a1b型。以猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性,TTSuV1a灵敏度可达9.2拷贝/μL,TTSuV1b灵敏度可达5.6×101拷贝/μL;批内变异系数均小于1%,批间变异系数均小于3%。将该方法与PCR法、PCR-DHPLC进行比较,结果证实该方法具有较好的准确性。对92份血清样本进行检测,发现有58份TTSuV1a阳性、62份TTSuV1b阳性、51份TTSuV1a和TTSuV1b共感染阳性。本研究建立的TTSuV实时荧光PCR法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。 相似文献
5.
为建立一种特异、灵敏、量化、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,设计1对PEDV N基因的特异性引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量RT-PCR的检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测。结果显示,所建立的实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999;不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生交叉反应,具有较强的特异性;灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍;重复性试验的变异系数均小于5%,重复性良好。对43份临床样品进行检测,结果比普通PCR多检出2份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法在特异性、灵敏度和重复性方面都很好,可用于临床PEDV检测。 相似文献
6.
为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
7.
猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 总被引：1，自引：1，他引：0
为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
8.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一种特异、灵敏、量化且耗时短的检测方法,通过设计1对PRRSV ORF7基因的引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量PCR(real-time PCR)的检测方法,对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验,并检测PRRSV疑似感染的临床病料。结果显示,所建立的real-time PCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=0.999,具有良好的线性关系;与传染性胃肠炎病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)无交叉反应,特异性强;与常规RT-PCR检测方法相比,灵敏度提高100倍;重复试验表明变异系数系数在1%以下,重复性良好。对27份临床样品进行检测,结果比常规PCR多检出3份阳性。说明建立的real-time PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面均相比良好,可用于临床PRRSV的检测。 相似文献
9.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。 相似文献
10.
《中国预防兽医学报》2016,(3)
为快速及定量的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2),本研究根据GenBank中登录的PRRSV和PCV2基因组确定了其基因保守序列,分别设计其特异性探针和引物,建立了PRRSV-PCV2双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性试验显示该方法对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒及猪瘟病毒的检测结果均为阴性。对PRRSV和PCV2的检测灵敏度均达10拷贝/μl。重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于4%。应用该方法对60份已知临床病料进行检测,结果检出PRRSV和PCV2阳性感染率分别为30.67%和35%,混合感染率为11.67%,与已知结果的符合率为100%。该方法具有敏感、快速、特异、定量、重复性、稳定性好等优点,在用于PRRSV和PCV2感染的快速鉴别诊断的同时,在细胞培养特性以及疫苗生产检测中也具有广阔的应用前景。 相似文献
11.
北美型猪蓝耳病病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
参考Genbank发表的美洲型猪蓝耳病病毒(porcine reproductive and respiratory syndrone virus,PRRSV)CH-1a(北美型经典PRRSV)、JXA1(北美型HP-PRRSV)等毒株的的主要结构蛋白基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对特异性的北美型PRRSV鉴别检测引物,其对经典PRRSV的扩增片段为511bp,对HP-PRRSV的扩增目片段为421bp。进行了该方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了美洲型PRRSV鉴别RT-PCR检测方法。应用此法对2010年1—12月收集的126份临床样品进行了检测,总体检出率达53.17﹪。结果表明该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于北美型PRRSV的临床发病鉴别检测及流行病学监测等工作。 相似文献
12.
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为了解沈阳及周边地区猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染情况和疫苗免疫效果,应用已建立的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒RT—PCR．检测方法在2011年1月～2013年6月期间,对来自辽宁省沈阳、大连、鞍山等16个市县地区的猪场和屠宰场的送检样品进行检测。结果发现,2011年辽宁省猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的阳性率为9．28％,2012年为27．3％,2013年上半年为0．6％,3年平均阳性率为12．1％;同时选择沈阳市5家规模化养猪场3年采集血清902份进行猪繁殖与呼吸障碍综合征疫苗免疫效果的评价,结果显示,2011年5个猪场猪繁殖与呼吸障碍综合征疫苗免疫抗体合格率为97．3％,2012年为98．8％,2013年上半年为94．8％,3年平均阳性率为97．5％;另外,对沈阳市某猪场免疫母猪所产仔猪的母源抗体进行为期7周的监测,发现,仔猪猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒母源抗体在7日龄时达到最大值,直到21日龄维持在较高水平,之后呈现下降趋势。 相似文献
14.
猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术的建立和初步应用 总被引：11，自引：0，他引：11
用胶体金标记纯化后的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程表达抗原,建立一种以微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV抗体的胶体金免疫层析法(GICA).特异性交叉试验证明GICA检测PRRSV抗体有较高的特异性.与其他方法对比检测证实了其敏感性.生产了一批免疫胶体金试纸条,检测36份临床样本,其中30份经免疫胶体金试纸条及ELISA、免疫荧光检测均为阳性.猪繁殖与呼吸综合征免疫胶体金抗体检测技术的建立为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体提供了一种快速简便的方法. 相似文献
15.
应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。 相似文献
16.
17.
Surveillance of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) in negative sow farms is usually performed by testing for the presence of antibodies against PRRS virus in serum with a commercial ELISA test. The objective of this study was to evaluate the feasibility of pooling serum samples for detection of PRRS virus antibodies by ELISA. The effect of pool size on the sensitivity and specificity of the ELISA test was evaluated by testing true positive samples and false positive samples, respectively, diluted in negative sera. The effect of three different cut-off values for the interpretation of the diagnostic test (0.4, 0.3 and 0.2) was evaluated as well. Furthermore, the obtained sensitivity and specificity estimates were used to calculate the herd sensitivity and herd specificity of surveillance protocols in different scenarios. The results showed that pooling serum samples to detect PRRSV antibodies resulted in a decrease in sensitivity and an increase in specificity, compared to testing individual samples, while the reduction of the s/p cut-off value recommended by the manufacturer (0.4) had the opposite effect. We describe an approach that can increase the herd sensitivity of a surveillance protocol for breeding herds, while maintaining high herd specificity and low testing costs. This can be achieved by sampling a larger number of animals and running the samples in pools. Therefore, the conventional monitoring protocols based on ELISA on individual samples can be improved by using pooled-sample testing. 相似文献
18.
为掌握酒泉市猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的流行情况,本试验在酒泉市五个农业县市采集638份样品,采用反转录-聚合酶链式反应(荧光RT-PCR)方法进行核酸检测,对不同地域、不同生长期、不同饲养模式的流行情况进行分析。结果显示,638份样品共检测出PRRS核酸阳性样品29份,PRRS阳性感染率为4.55%。不同地域PRRS阳性感染率介于0-7.95%;屠宰场、规模场、散养户PRRS阳性感染率分别为0、2.96、6.82%;种公猪、育肥猪、仔猪、母猪PRRS阳性感染率分别为0、3.1、5.38、6.36%。结果表明,酒泉市PRRS呈散发流行,规模养殖场标准化高,饲养管理模式先进PRRS阳性感染率低,此病仔猪和母猪更容易感染,本试验将对我市PRRS综合防控提供技术支撑。 相似文献
19.
根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。 相似文献