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1.
非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。 相似文献
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建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测禽白血病病毒(ALV)。选取ALV病毒的LTR序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有ALV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。阳性标准品在3.0×102~3.0×107个拷贝共6个数量级的范围内,定量PCR反应有"S"型扩增曲线,检测灵敏度最低为30个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡传染性贫血病毒和马立克病病毒核酸都没有扩增反应。实时定量PCR检测ALV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。 相似文献
3.
为建立检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,本试验克隆了鸭痘病毒P4b基因,构建重组质粒pMD-DPV-P4b,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的禽痘病毒P4b基因设计合成1对特异性引物及与该引物相匹配的特异探针。以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-DPV-P4b为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了一种检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法与禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒等其他水禽病毒,以及山羊痘病毒和鸡痘病毒等其他痘病毒均无交叉反应,特异性好。该方法最低检测限为1.29×102拷贝/μL,比普通PCR检测方法高100倍。组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本试验所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适用于鸭痘病毒的检测。 相似文献
4.
根据新城疫病毒F基因的裂解位点序列,设计合成一对引物和TaqMan探针,以本室构建并保存的鹅源新城疫病毒ZJ1株F基因阳性重组质粒作为中、强毒力新城疫病毒RNA定量检测的标准品,建立检测方法。结果表明本试验建立的标准曲线循环阈值（Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为3拷贝/μL,对禽流感病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为中、强毒力新城疫病毒检测提供了一种快速高效的定量检测方法。对28株标准分离株强弱毒力的检测与经典病毒分离方法符合率达100%,对187份临床样品的检测,二者结果符合率接近90.0%。在新城疫病毒临床样品快速检测、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2019,(9)
为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL～1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。 相似文献
7.
实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒 总被引：3，自引：0，他引：3
根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)M基因上的保守序列,合成引物和荧光标记探针,以阳性AIVM基因质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应(RRT-PCR)检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为5拷贝/μL,相当于5个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为AIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。对500份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果阳性?阴性数与经典病毒分离方法符合率分别为91.2%?99.4%。在AIV临床样品筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。 相似文献
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鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 相似文献
9.
试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 相似文献
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《中国兽医杂志》2019,(5)
为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。 相似文献
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NDV长春株生物学特性及与国外毒株HN蛋白基因的同源性比较 总被引：4，自引：2，他引：2
以新城疫病毒（NDV）长春株接种9日龄SPF鸡胚增殖后,进行了蚀斑纯化（三代）鉴定,差数、蔗糖密度梯度离心提纯和生物学特性鉴定。结果表明,该病毒的鸡胚平均致死时间（MDT）大于168h,雏鸡脑内致死性（ICPI）为0.25,雏鸡静脉致死性（IVPI）为0,血凝解脱时间超过120h,血凝素热稳定性56℃ 5min 仍具有血凝活性。系统发育进化树分析表明,NDV长春株与La Sota株亲缘关系最近,为弱毒株。参考多株NDV HN基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR一次性扩增出NDV长春株的全长HN基因。将该HN基因插入pKS（-）后,进行了序列测定。序列分析表明,该HN基因苷酸长度为1731bp,编码577个氨基酸,序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基,与国外发表的NDV毒株序列相符,核苷酸同源性为88.1%～98.8%,推导的氨基酸同源性为91.1%～98.8%。 相似文献
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从山东某鸡场的产蛋下降而无其他典型新城疫（Newcastle Disease）症状的高抗体蛋鸡群中分离到一株病毒。经过试验鉴定,该分离株具有血凝性,且可被ND标准阳性血清所抑制和中和,不能被AI（H5亚型与H9亚型）标准阳性血清抑制;该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（h）为50．4h,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数（ICPI）为1．85,6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）为2．42,回归试验鸡出现了新城疫症状和病变,经外源病毒检测及回归试验该病毒株被确定为新城疫病毒,并属强毒型,命名为ShD-5-04。 相似文献
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从山东某鸡场的产蛋下降而无其他典型新城疫(Newcastle Disease)症状的高抗体蛋鸡群中分离到一株病毒。经过试验鉴定,该分离株具有血凝性,且可被ND标准阳性血清所抑制和中和,不能被AI(H5亚型与H9亚型)标准阳性血清抑制;该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间(h)为50.4 h,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数(ICPI)为1.85,6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42,回归试验鸡出现了新城疫症状和病变,经外源病毒检测及回归试验该病毒株被确定为新城疫病毒,并属强毒型,命名为ShD-5-04。 相似文献
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鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）和新城疫（ＮＤ）病毒接种同一鸡胚收取种毒试制ＩＢＤ、ＮＤ二联弱毒冻干疫苗,并按《规程》方法分别检验。结果证明安全、效力均能达到合格标准,两种病毒互相不干扰抗体的产生。 相似文献
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从山东某鸡场的产蛋下降而无其他典型ND症状的高抗体蛋鸡群中分离到一株病毒。经过试验鉴定．该分离株具有血凝性，且可被ND标准阳性血清所抑制和中和，不能被AI（H5亚型与H9亚型）标准阳性血清抑制；该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）为50．4，1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数（ICPI）为1．85，6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（WPI）为2．42，回归试验鸡出现了新城疫症状和病变，该病毒株确定为新城疫病毒强毒型，并暂命名为ShD-dzh04。 相似文献
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新城疫病毒的反遗传操作技术研究进展 总被引：4，自引：1，他引：4
鸡新城疫 (ＮＤ)是由ＮＤＶ引起的鸡和火鸡的急性高度接触性传染病 ,是严重危害养鸡业的最重要的疾病之一 ,我国每年因此造成的损失极其严重。尽管常规疫苗基本控制了该病的大规模毁灭性流行 ,但并没有使ＮＤ得到根本控制。新城疫 (ＮＤ)是危害世界养禽业的最严重的禽病之一 ,所造成的经济损失十分惨重。它的病原是新城疫病毒(ＮＤＶ) ,属于副粘病毒科副粘病毒亚科腮腺炎病毒属。同其它副粘病毒一样 ,ＮＤＶ含有单股负链基因组ＲＮＡ ,长度约15 186个碱基 ,编码 6种结构蛋白 :核衣壳蛋白 (ＮＰ)、磷蛋白(Ｐ)、基质蛋白 (Ｍ)、融合蛋白 (Ｆ)… 相似文献
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为对1例疑似新城疫病死孔雀进行确诊,采集病死孔雀的心、脾、肺制成匀浆,接种9~11日龄鸡胚进行病毒分离,并采用血凝和血凝抑制试验对分离病毒进行鉴定。结果表明,该孔雀死于新城疫。 相似文献
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鸭源新城疫病毒的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从病死肉鸭肝脏中分离到2株病毒(ZH1、ZH2),均能够凝集鸡、肉鸭、绵羊、山羊、猪、人、兔、牛等的红细胞,且这种血凝性可被NDV标准阳性血清所抑制.参照NDV毒力判定标准及其方法对分离毒株ZH1、ZH2进行了鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)、鸡胚半数感染量(EID50)以及1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定,结果ZH1、ZH2株的MDT为52 h和44 h,EID50为106.4/0.1mL和108.64/0.1mL,ICPI为1.93和1.975.表明这2株分离病毒均为NDV强毒株. 相似文献