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1.
《浙江农业学报》2016,(11)
采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的c DNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。 相似文献
2.
【目的】克隆大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor30)基因GPR30,研究其在成鱼各组织中的表达状况;用EE2(17α-ethynylestradiol)处理大鳞副泥鳅雌性幼鱼后,检测GPR30、ERαmRNA在幼鱼肝脏和卵巢中的表达状况,探究EE2对雌激素膜受体GPR30和经典雌激素核受体ERα基因表达的影响,推测GPR30可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆大鳞副泥鳅GPR30,对其核苷酸序列及所编码的氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,研究GPR30mRNA在大鳞副泥鳅成鱼性腺、肠道、肌肉、肾脏、脑、肝脏、鳃、眼睛等组织中的表达状况,以及经不同质量浓度(1,5,25ng/L)EE2处理后雌性幼鱼肝脏和卵巢中GPR30和ERαmRNA的表达。【结果】克隆获得了GPR30,该基因全长2 152bp,阅读框全长1 062bp,编码353个氨基酸,该基因氨基酸序列与斑马鱼的GPR30氨基酸序列相似性最高,达92.9%。GPR30氨基酸序列的比对结果显示,大鳞副泥鳅与其他脊椎动物的GPR30结构域一致。荧光定量PCR分析表明,GPR30在大鳞副泥鳅成鱼卵巢中表达最高,在雄鱼肠道中表达最低,且GPR30mRNA在雌雄大鳞副泥鳅的性腺中差异性表达,在卵巢中的表达量较精巢中高702倍。EE2暴露试验显示,在5ng/L EE2处理组的卵巢及1和5ng/L EE2处理组的肝脏中,GPR30有略微增长;随着EE2质量浓度的增高,ERαmRNA在肝脏中的相对表达水平较对照组显著增长。【结论】成功克隆了大鳞副泥鳅GPR30,其与哺乳动物的GPR30有相似的结构和功能,可能与雌激素效应存在密切关系。在基因转录水平上,GPR30与ERα可能不存在直接的显著相关关系。 相似文献
3.
克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1 905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1 575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hiTAIL-PCR克隆获得2 040 bp的5′侧翼序列,在该序列上预测到典型元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。12月龄四倍体泥鳅的体长、体质量均显著高于二倍体,但性腺发育明显滞后于二倍体。cyp19a1a和cyp19a1b分别在二倍体、四倍体泥鳅的性腺和脑中的表达量最高。倍性间比较结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体(除精巢外);cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达量显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达量显著低于二倍体。综合分析上述结果,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关,较晚的性成熟有利于泥鳅将更多能量用于个体生长。由于cyp19a1及其催化产生的雌激素还可以通过GH-IGF通路调节鱼类的生长,推测cyp19a1在泥鳅倍性间的差异表达可能与二倍体、四倍体间的生长生殖差异密切相关。 相似文献
4.
角蛋白18(K18)是角蛋白的一种,为中间纤维蛋白,是细胞骨架的必要组成部分。采用RACE法克隆了大鳞副泥鳅K18基因cD NA的全长序列,并运用实时荧光定量PCR技术探讨其在不同组织中的表达。结果表明,克隆得到的大鳞副泥鳅K18基因cD NA序列全长为1 718 bp,其中包含1个长1 296 bp开放阅读框,编码431个氨基酸,蛋白质相对分子量48.66 ku。同源性分析显示,大鳞副泥鳅K18与泥鳅的相似性最高为98%,与斑马鱼、金鱼、虹鳟、白斑狗鱼等物种K18也存在不同程度的相似性。系统进化分析表明,大鳞副泥鳅与其他物种的K18系统发育同源,并与泥鳅的关系最为密切。通过实时荧光定量PCR分析,K18基因在大鳞副泥鳅的肠、肌肉、胃、心脏、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8种组织中都有表达,其中,肠表达最高,心脏最低。研究旨在为大鳞副泥鳅的分子生物学研究提供参考资料,并为更好地了解大鳞副泥鳅细胞骨架结构系统提供依据。 相似文献
5.
从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法克隆大鳞副泥鳅生长激素基因(pGH)cDNA。结果表明,克隆到的pGH的开放阅读框包括633 bp,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,GenBank注册号为DQ350432。把pGH成熟肽的cDNA插入真核表达载体pPIC3.5K,PCR技术、酶切和测序证明重组子中确实定向插入了pGH成熟肽片段;将重组的pPIC3.5K-pGH用SalⅠ酶切后,转化巴斯德毕赤酵母GS115,PCR技术筛选证明pGH已经整合到酵母染色体上。从而成功克隆大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA,并构建了胞内真核表达载体pPIC3.5K-pGH。 相似文献
6.
为探究泥鳅ELOVL1的功能和作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆泥鳅的elovl1基因,并分析elovl1基因的表达规律,最后将泥鳅分别暴露在26℃和8℃下饲养30d,研究低温胁迫对泥鳅脂肪酸组成、组织形态及elovl1基因表达的影响。结果发现:elovl1a全长为2 216bp,ORF为948bp,编码315个氨基酸;elovl1b全长为1 895bp,ORF为963bp,编码320个氨基酸。氨基酸序列特征如下:1个高保守的氧化还原组氨酸簇(HXXHH),多个跨膜区,氨基酸序列C端均含有内质网滞留信号(KXKXX)。elovl1a和elovl1b在所有组织中表达,elovl1a在每个组织的表达量均低于elovl1b。低温下总SFA明显降低(P0.05),总MUFA显著增加(P0.05)。低温显著诱导elovl1a、elovl1b表达。研究结果表明:泥鳅ELOVL1在脊椎动物中保守,ELOVL1可能在机体适应低温时,参与产生能量,起到重要的作用。 相似文献
7.
2种泥鳅生长激素基因cDNA的克隆和原核表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了泥鳅和大鳞副泥鳅的生长激素(GH)基因cDNA,分析了其核苷酸序列和推测的氨基酸序列.结果表明:2种泥鳅生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.在cDNA序列上2者有11个核苷酸的差异;在蛋白质水平上,2者的差异仅为1个氨基酸,位于信号肽中,在成熟多肽中,2者的氨基酸序列相同.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体.细菌裂解液沉淀溶于浓度为8mol/L的尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量为24 kDa的单一蛋白带. 相似文献
8.
为探讨雌激素受体基因与鱼类雌雄及倍性生长差异之间的相关性，选取雌性生长快于雄性、且四倍体生长快于二倍体的泥鳅为研究对象，首先克隆泥鳅雌激素受体基因，获得ERα（1 821 bp）、ERβ1（1 008 bp）和ERβ2（1 197 bp）的cDNA序列，氨基酸序列比对发现泥鳅ERs分别与鲤科鱼类相应亚型具有较高的同源性。采用qRT-PCR检测ER基因在二倍体泥鳅性成熟前后5个关键时期的表达情况及二倍体、四倍体相关组织间的差异表达。结果显示，3个基因在雌雄个体性成熟前后脑、肌肉、肝脏和性腺组织中均存在差异表达，其中ERα 在泥鳅雄性个体脑、肌肉和性腺组织中的表达量显著高于雌性（P<0.05），而在雌性肝脏组织中的表达量普遍高于雄性（P<0.05）；ERβ1和ERβ2在精巢组织中的表达量一直处于较高水平。泥鳅倍性间的比较结果显示，3个ER基因在泥鳅二倍体脑组织中的表达量显著高于四倍体的表达量，且雄性的表达量均高于雌性，其中〖JP2〗ERα表达差异最为显著。本研究结果表明，无论是针对倍性生长差异还是雌雄生长差异，ERα均表现为在生长较慢（二倍体、雄性）个体脑组织中有相对高表达，推测脑组织中ERα 基因对鱼类个体生长速度具有一定抑制作用。 相似文献
9.
[目的]克隆大刺鳅(Mastacembelus armatus)促黄体生成素(LH)基因及明确其表达规律,为进一步阐明LH基因在大刺鳅性腺发育过程中的生理功能及揭示大刺鳅的生殖调控机理提供参考依据.[方法]采用RACE克隆大刺鳅LH基因cDNA全长序列,从GenBank中选择硬骨鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物等物种的LH氨基酸序列,通过ClustalX 2.1进行氨基酸序列比对,以MEGA 6.0中的邻接法(NJ)构建系统发育进化树,并应用实时荧光定量PCR检测分析大刺鳅LH基因在不同组织及不同性腺发育期的表达情况.[结果]大刺鳅LH基因cDNA序列全长799 bp,包括224 bp的5'非编码区(5'-UTR)、131 bp的3'非编码区(3'-UTR)和444 bp的开放阅读框(ORF),共编码147个氨基酸残基,第1~22位氨基酸残基组成其信号肽区域.大刺鳅LH氨基酸序列C-末端区域高度保守,但N-末端区域与其他硬骨鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物存在明显差异.大刺鳅LH氨基酸序列与其他鱼类的LH氨基酸序列同源性较高,其中与黄鳝(Monopterus albus)的亲缘关系最近.大刺鳅LH基因在其脑组织中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05);在卵巢、心脏、肝脏和精巢中的相对表达量次之;大刺鳅LH基因在不同发育期卵巢和精巢中的表达变化趋势一致,从II期开始其相对表达量随之增加,至V期时达峰值.[结论]大刺鳅LH氨基酸序列具有高度保守区域,其基因在各组织中广泛表达,尤其在脑组织和性腺中具有较高表达量,提示LH的靶基因可能在脑—垂体—性腺轴上,参与大刺鳅的性腺发育调控,主要促进卵母细胞和精子成熟并刺激排卵或排精. 相似文献
10.
为探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)基因在二倍体和四倍体泥鳅之间的表达差异及其与DNA甲基化的相关性,克隆二倍体、四倍体泥鳅的CDS序列和启动子序列,并分别采用qRT-PCR和亚硫酸氢盐测序技术(BSP)分析IGFBP-1在二倍体、四倍体泥鳅中的表达水平及启动子区和第一外显子区的甲基化水平。结果显示,泥鳅的IGFBP-1基因CDS序列长789bp,编码262个氨基酸,二倍体、四倍体泥鳅间有5bp的差异,但氨基酸序列完全相同。在二倍体、四倍体中分别克隆得到2 341bp和2 331bp的启动子序列,倍性间的序列相似度达99%,启动子序列中包含典型元件TATA-box,以及SP1、CREB、C/EBP、POU2F2、GATA-2/3/4和SRY等转录因子结合位点。泥鳅的IGFBP-1基因主要在肝脏中表达,且四倍体泥鳅肝脏中IGFBP-1的表达水平显著高于二倍体(P0.01)。四倍体泥鳅IGFBP-1基因启动子及第一外显子区的甲基化水平均比二倍体低,其中四倍体肝脏中的甲基化水平显著低于二倍体(P0.01)。综合分析研究结果表明,在IGFBP-1基因主要表达的肝脏组织中,其mRNA表达水平与DNA甲基化水平呈负相关,启动子区较高的甲基化可能抑制了二倍体泥鳅IGFBP-1基因的表达。 相似文献
11.
主要组织相容复合体（major histocompatibility complex,MHC）是一类具有高度多态性的分子,在脊椎动物的先天免疫应答中起到重要作用。根据已报道鱼类的MHCⅠα基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR和RACE技术克隆三角鲂MHCⅠα基因cDNA序列全长,命名为Mete-UAA,并对其进行生物信息学分析。结果显示,Mete-UAA全长为2 102 bp,包含1 044 bp的开放阅读框,编码347个氨基酸。编码的MHCⅠα蛋白质预测分子量为38 699.18,等电点5.23,含有16个氨基酸组成的信号肽,具有亲水性,定位于细胞膜上,具有1个N-糖基化、3个O-糖基化和39个磷酸化的潜在位点。氨基酸序列同源性比对发现,Mete-UAA氨基酸序列与团头鲂同源性最高为75.79%,与草鱼同源性稍低于团头鲂,为75.25%。Mete-UAA具有MHCⅠα的典型结构特征,包含1个前导肽、3个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区。二级结构分析显示,Mete-UAA蛋白质中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为25.94%、9.22%、26.80%和38.04%。基于转录组学分析表明,感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后三角鲂MHCⅠα基因表达呈总体下降趋势。本研究从三角鲂肝中成功克隆MHCⅠα基因,分析了其生物信息学特征,为后续研究MHCⅠα参与调控三角鲂先天免疫应答的机制提供理论基础。 相似文献
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应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。 相似文献
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水稻盐胁迫相关基因sos5的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%。 相似文献
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蝉拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛应用于生物防治。本研究根据GenBank中已登录的淡紫拟青霉、粉拟青霉、球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因序列的同源性比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3'/5'-RACE相结合的方法,从蝉拟青霉中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease)cDNA基因序列。cDNA全序列为2 031 bp,该序列5'-端和3'-端的非编码序列长度分别为170 bp和262 bp,开放阅读框为1 599 bp,编码532个氨基酸,信号肽长度为18个氨基酸,前肽长度为133个氨基酸。该基因编码的蛋白序列与虫草棒束孢(Isaria farinosa)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、蛹虫草(Cordyceps militaris)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)类枯草杆菌蛋白酶有较高的同源性,同源性分别为88%、88%、89%和71%。成熟蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶活性位点,同时有5个半胱氨酸,4个潜在的N-糖基化位点,位于细胞的液泡中与分泌途径相关,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主。 相似文献
16.
通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。 相似文献
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[目的]为研究以鼠兔LDH-C4为靶蛋白的节育型鼠药奠定基础。[方法]采用简并引物PCR克隆得到黑唇鼠兔LDH-C基因的EST序列,再根据EST序列采用RACE技术克隆出基因的开放阅读框（ORF）全长,和3’UTR序列。[结果]整个cDNA全长1 498 bp,其中ORF长996 bp,编码332个氨基酸,3’UTR长486 bp。ORF序列比对显示LDH-C基因在大的分类单位上均很保守。系统树分析显示黑唇鼠兔的LDH-C基因和灵长类及偶蹄目的遗传距离较近,和啮齿目较远。[结论]成功的克隆得到了黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA序列。 相似文献
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[目的]从能源植物象草中克隆出参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)的cDNA序列及全长DNA序列,进而分析其序列特征。[方法]采用传统RT-PCR及RACE技术克隆象草CCR序列,并利用NCBI,ProtParam,ProtScale,TMHMM,TargetP,SignalP,Pfam20.0,Prosite,Swiss-Model和ClustalW2等在线分析程序以及DNAman,DNAstar和MEGA5软件对得到的序列进行生物信息学分析。[结果]克隆得到了象草CCR包含编码区和3’非翻译区的长为1316bp的cDNA序列以及包含5个外显子和4个内含子的全长为6133bp的DNA序列。通过生物信息学分析得知,象草CCR基因编码长为369个氨基酸的蛋白,该蛋白二级结构元件以无规则卷曲和α-螺旋为主,属于依赖NAD表异构酶/脱氢酶家族,其辅助因子结合区域和底物结合位点高度保守。[结论]成功从象草中克隆出肉桂酰辅酶A还原酶基因。它具有CCR同源基因典型的特征。获得的各种生物信息学数据为今后开展此酶的深入研究以及对象草的更好利用提供了一定的理论参考价值。 相似文献
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利用长片段PCR、基因组步移法及T-A克隆技术,成功克隆出河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)GH基因全长序列,提交至GenBank获得登录号MH717101。河川沙塘鳢GH基因全序列长5 120 bp,5'端和3'端侧翼序列长度分别为920、682 bp,经预测,上游区域含有MF3、GAGA factor、HNF-3alpha、C/EBP、R2、GATA-1等多种转录调控元件;转录单元长3 518 bp,包含4个内含子和5个外显子,4个内含子大小分别为75、333、2 070和121 bp,5个外显子长度分别为150、131、117、138和373 bp,第3内含子长达2 070 bp,其长度是翘嘴鲌(Culter alburnus)第3内含子的4倍以上;开放阅读框区(open reading frame,ORF)为594 bp,编码由197个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。河川沙塘鳢与鲈形目、鲉形目、鲤形目、鲇形目等13种鱼类的氨基酸序列同源性比较表明,其与彼氏冰鰕虎鱼(Leucopsarion petersii)同源性最高,为83.8%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)同源性最低,为49.1%,在180~197氨基酸序列处,河川沙塘鳢表现出高度不保守性,与所列鱼类氨基酸排列均完全不一致。该研究结果为进一步研究河川沙塘鳢GH基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。 相似文献
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酪氨酸硫化转移酶(Tyrosylrotein sulfotransferase,TPST)在酪氨酸硫化修饰过程中起调节作用.试验参照人、鼠、牛等动物的TPST1 mRNA全长序列设计引物,通过电子克隆结合RT-RCR的方法首次克隆获得包括完整CDS区的猪TPST1基因cDNA序列(HQ439987),分析其核苷酸序列及... 相似文献