共查询到20条相似文献，搜索用时 78 毫秒
1.
大口黑鲈病毒性溃疡病病原的分离和鉴定 总被引：8，自引：1，他引：7
对广东省佛山地区2008年夏季高温时期暴发的大口黑鲈溃疡病的病原进行分离,从患病鱼的病灶肌肉组织中分离到5株嗜水气单胞菌,人工感染健康大口黑鲈,均未出现溃疡暴发病的典型症状病鱼体表大片溃烂,裸露肌肉坏死并有出血,尾鳍、胸鳍和背鳍基部红肿溃烂。制备病灶肌肉组织的除菌过滤液,背部肌肉注射感染健康大口黑鲈,7 d后出现典型的溃疡病症状。取自然发病鱼和人工感染的患病鱼病灶肌肉组织制作超薄切片,经电镜观察,均发现组织中有大量病毒颗粒,病毒粒子有囊膜,呈六角形,为正20面体对称结构,大小约为145.5 nm。根据已知虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因序列设计特异引物,提取人工感染发病鱼病灶肌肉组织的DNA进行PCR扩增,将扩增片段进行序列测定与分析,结果表明该序列与已报道的虹彩病毒MCP基因有着较高同源性（39.5％～100％）。从电镜观察和MCP基因测序分析结果确认该病毒为虹彩病毒科蛙病毒属中的一种病毒,与国外报道的大口黑鲈病毒（LMBV）在分子特性和引起的疾病特征上有一定差异。研究结果表明引起大口黑鲈溃疡性暴发病的病原是虹彩病毒,将该病暂命名为大口黑鲈病毒性溃疡病。 相似文献
2.
大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大口黑鲈(Micropterussalmoides)中的病毒性溃疡综合征,本研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouthbassulcerativesyndromevirus,LBUSV)主要衣壳蛋白(MCP)基因,该基因编码区全长1392bp。通过序列比较分析,在MCP基因内确定了一段241bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物,经过优化PCR反应条件,建立了可以快速检测大口黑鲈溃疡综合征病毒的PCR方法。实验表明,在PCR进行到30个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是104拷贝数/μL,相当于104个病毒粒子。利用该方法,从天然感染LBUSV的大口黑鲈脾脏组织DNA可扩增出241bp的片段,而健康大口黑鲈和感染了传染性脾肾坏死病毒样病毒的大口黑鲈脾脏组织则没有扩增条带。本研究建立的PCR检测方法具有检测快速、成本低、准确性高的特点,适用于大范围早期病害诊断的推广应用。 相似文献
3.
采用电子显微镜观察和细胞培养等技术, 从湖北黄陂某养殖场患病大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内发现并分离到一株蛙病毒。患病大口黑鲈的临床症状主要表现为体表出血、溃疡, 肝脏发白。将病鱼内脏组织匀浆超微滤液接种鳜脑细胞系(mandarin fish brain, MFB)细胞能产生典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 病毒滴度达到 108.36±0.15 TCID50/mL。细胞培养病毒的超薄切片电镜观察结果显示, 细胞质中存在大量直径约为 150 nm 左右的正六边形病毒粒子, 呈晶格排列。细胞培养病毒的人工感染大口黑鲈试验结果显示, 7 d 内试验鱼死亡率高达 100%, 其临床症状与自然发病鱼相似。采用大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)的特异性 PCR 检测方法对患病鲈组织样品和细胞培养病毒样品进行检测, 均能扩增出 241 bp 的单一目的条带。进一步根据 GenBank 中 LMBV 主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物, 均能从上述样品中扩增出 1392 bp 的 MCP 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长。将 MCP 氨基酸全序列进行比对, 结果显示其与 Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型及大口黑鲈溃疡综合征病毒的 MCP 氨基酸序列同源性高达 100%。系统进化结果显示, 与感染鱼类的虹彩病毒科蛙病毒属病毒, 如鳜鱼蛙病毒、Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型和大口黑鲈溃疡综合征病毒等聚成一支。这些结果证明, 该分离株为虹彩病毒科蛙病毒属的成员, 暂命名为大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus, LMBRaV)湖北株 LMBRaV-HB001。病毒敏感细胞系筛选试验结果表明, 病毒 LMBRaV-HB001 感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼性腺细胞(grass carp ovary, GCO)、大鲵肌肉细胞(giant salamander muscle, GSM)和鲫脑组织细胞(gibel carp brain, GiCB)均能产生典型 CPE, 病毒滴度可达 108.0 TCID50/mL 以上。本研究首次在湖北省养殖大口黑鲈体内分离与鉴定了 LMBRaV 病毒, 建立了病毒的细胞培养方法, 为进一步研究该病毒的传播、诊断和防控技术提供了重要参考。 相似文献
4.
为探讨大口黑鲈蛙病毒（LMBV）的分子流行规律及在感染后的组织病理变化，实验对2019—2021年采集的723份患病大口黑鲈样品进行荧光定量PCR （qPCR）检测。结果显示，LMBV的阳性率为63.62%，挑选阳性样品接种鳜脑细胞（Chinese perch brain cells,CPB），共获得93株LMBV。通过对分离株MCP、ATP酶、DNA聚合酶和甲基转移酶基因进行PCR扩增与测序分析，发现上述基因在LMBV分离株中均保守，其中MCP、ATP酶基因一致性均为100.0%、甲基转移酶基因一致性为99.7%～100.0%、DNA聚合酶基因一致性为99.8%～100.0%。选取1株LMBV毒株感染健康大口黑鲈，采用qPCR方法对不同组织中的病毒载量进行检测，结果显示，大口黑鲈蛙病毒在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠和脑等组织中均有分布，人工感染LMBV后的前5天病毒载量逐步升高；感染后第5天，心脏中病毒载量最高（9.5×105个/mg拷贝），脑组织中病毒载量最低（2.9×102个/mg拷贝）。组织病理结果表明，LMBV可导致大口黑鲈多种组... 相似文献
5.
2018年7月,宁波象山某养殖场内银鲳出现集中死亡现象,累积死亡率高达80%以上,为探究此次疾病暴发的原因,本研究通过对患病银鲳进行组织病理学分析、透射电镜观察、病原的分子生物学检测及分析来对其病原进行鉴定,以便制定合理的防控措施。患病银鲳临床表现为厌食、身体失衡、脾脏肿大、肝脏颜色异常等病征。组织病理学观察发现,患病银鲳肝脏、脾脏和肾脏均出现直径10～15μm、细胞质嗜碱性的肿大细胞。进一步的透射电镜观察则在脾脏、肾脏等组织细胞内发现了病毒包涵体结构以及大量的病毒粒子,直径为140～160 nm。通过虹彩病毒特异性PCR检测发现,患病组织样品为虹彩病毒阳性。此外,通过病毒主要衣壳蛋白基因(MCP)序列分析,发现银鲳源病毒与大黄鱼虹彩病毒(GenBank登录号:AY779031.1)MCP同源性最高为99.76%,认为此分离病毒属于虹彩病毒科、肿大细胞病毒属、真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)类群。本实验首次报道了全人工养殖环境下银鲳感染虹彩病毒的病例,该研究将为养殖银鲳虹彩病毒病的诊断和防治提供重要的参考依据。 相似文献
6.
2008年11月～2010年11月,采集山东海域大菱鲆、石鲽、鲈鱼各20批,按照世界动物卫生组织推荐的PCR检测方法对真鲷虹彩病毒病(Red Sea Bream Iridoviral Disease,RSIVD)进行初步调查.结果显示,共检出4例RSIVD感染样品.以真鲷虹彩病毒(Red Sea Bream Iridovirus,RSIV)和传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)主要衣壳蛋白基因为基础,设计简并引物,PCR扩增本次检出阳性样品的RSIV/ISKNV MCP基因.将MCP基因PCR扩增产物测序,提交GenBank,并以MCP基因为基础,对被检出的阳性样品进行虹彩病毒属系统分类,绘制进化树.由进化树得出,4例阳性病毒株均属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属. 相似文献
7.
为探明2021年3月福建某水库养殖大口黑鲈疾病暴发的原因,实验从患病大口黑鲈肝脏、肾脏、脾脏中分离优势菌,通过人工感染实验确定病原菌,并综合16S rDNA基因序列分析、生理生化和质谱特征等技术对该病原菌进行种属鉴定,同时,进行毒力基因检测、药物敏感性实验以及组织病理学观察。结果显示,从病鱼脾脏中分离获得1株优势菌并鉴定为鲁氏耶尔森氏菌;该菌株对大口黑鲈的半致死剂量为3.8×105 CFU/尾;该菌株携带yrP1、yhl A、yhl B等毒力基因,对恩诺沙星、盐酸多西环素、氟甲喹、硫酸新霉素、氟苯尼考等5种药物相对敏感。组织病理学观察发现,鲁氏耶尔森氏菌的感染造成大口黑鲈肝脏、肾脏、脾脏不同程度的损伤,表现为明显的变性、坏死及炎症细胞的浸润等。本研究首次报道了鲁氏耶尔森氏菌对养殖大口黑鲈的致病性,可为养殖大口黑鲈鲁氏耶尔森氏菌病的诊断和药物防治提供参考依据。 相似文献
8.
2017年8月,山东省烟台市某养殖场网箱养殖的斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼突然发病并大量急性死亡。疾病调查显示,养殖海域水温为26℃~28℃;病鱼为4~5月龄,全长为(16.3± 1.6) cm,体重为(156.9±37.0) g;80万尾斑石鲷幼鱼2周内累积死亡率达90%以上,经济损失惨重。临诊检查发现,病鱼体表无明显损伤,但活力差、呼吸急促。剖检可见病鱼脾肿大、质地脆、易碎,肾糜烂,肝有出血点。组织切片观察发现,病鱼脾、肾造血组织中可见许多直径约为20 μm的肿大细胞,肿大细胞内含有大量直径约为145 nm、呈六边形的病毒颗粒。用过滤除菌的病鱼脾组织匀浆液,腹腔注射感染健康斑石鲷,感染组14 d内累积死亡率达95%。人工感染病鱼表现出与自然发病鱼类似的外观症状,且在脾、肾组织切片中也可观察到大量的肿大细胞及相似的病毒粒子。使用特异性PCR引物,从自然发病鱼和人工感染病鱼的肝、脾和肾组织中均检测到鱼类虹彩病毒的高强度感染。克隆、测序得到了1362 bp的病毒主要衣壳蛋白基因(MCP),序列比对显示,该病毒的MCP序列与真鲷虹彩病毒(RSIV) RIE12-1的相应序列完全相同。构建的虹彩病毒系统发育树也显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群,是RSIV的一个分离株。本研究首次证实RSIV可以导致斑石鲷大规模死亡,研究结果为诊断和防治斑石鲷病毒病提供了重要参考。 相似文献
9.
2020年5月,广东广州某野生动物保护基地爆发疑似病毒引发的疾病。现场采样发现,病鲵体长约2 m,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究采用胖头鲤肌肉细胞系(fat head minnow epithelial cells, FHM)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大鲵中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大鲵虹彩病毒广州分离株(CGSIV-GZ)。FHM经患病大鲵组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的FHM细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,FHM细胞中存在大量直径约100～120 nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鲵组织样本进行PCR扩增,获得了431 bp的目的基因片段,测序后经采用BLAST软件分析,发现其与GenBank中的蛙病毒衣壳蛋白基因同源性达96%～99%。确认本次野生动物保护基地大鲵发生大规模死亡是蛙病毒感染所致。 相似文献
10.
1999年 8～ 10月广东沿海网箱养殖的眼斑拟石首鱼 (Sciaenopocellatus)流行一种暴发性传染病 ,经抗菌药或杀虫剂处理均无效。为查明病因 ,取病鱼镜检 ,未发现寄生虫 ,也分离不到细菌。电镜观察 ,可见病鱼的脾脏细胞内有截面为六边形、直径约 15 0nm的病毒颗粒 ,且脾、肝、肾都有一定程度的病变 ;用 2对日本所报道的虹彩病毒特异引物进行PCR扩增 ,在病鱼的脾脏样品中扩增出 2条大小与所报道的虹彩病毒扩增产物吻合的特征带 ,故初步认定虹彩病毒是眼斑拟石首鱼暴发性传染病的主要致病原 相似文献
11.
Fish were sampled individually, at rest, following air exposures of up to 8 min, during recovery from a 5 min air exposure or after a 5 minute chase. The spleen was photographedin vivo at rest and following 5 min air exposure in one fish. The effect of individual versus serial sampling from the same tank and of MS222 anaesthesia was also examined. Spleen hemoglobin content (SpHb), spleen somatic index (100 × spleen weight/body weight; SSI), blood hemoglobin concentration (Hb), and hematocrit (Ht), were measured. Mean cell hemoglobin concentration (MCHC), erythrocyte reservoir size, and relative contributions of reservoir release, erythrocyte swelling, and plasma water loss to hemoconcentration were calculated. The splenic reservoir contained 0.54 g Hb/kg body (21% of total body Hb), most of which it released between 1 and 3 minutes after the onset of air exposure. The spleen released more than 95% of the erythrocytes it contained at rest within 8 min. The release accounted for 31% of the 5.65 g/dl rise in Hb and 23% of the 26.6% observed increase in Ht after 8 minutes of air exposure. The balance of the increase was caused by erythrocyte swelling and fluid shifts reducing plasma volume. Animals exercised for 5 min showed changes similar to those in fish air exposed for 5 min. Recovery of all parameters was complete in 3 to 6 h, with the exception of MCHC which recovered in 30 min. Serial sampling produced a decrease in SpHb, and R1Wt and induced a significant hemoconcentration. MS222 did not cause erythrocyte release, but failed to prevent it after handling. Many previous reports of Ht and Hb in resting fish are probably high because they were taken under conditions that would cause the spleen to release its contents. 相似文献
12.
鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是近年来危害广东地区鳜养殖业的主要病原，本文用回接感染健康鳜获得病毒原料，分离纯化了大量高纯度的ISKNV病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，直径平均为150mm，抽提病毒核酸，对其基因组DNA进行酶切分析，病毒基因组为双链DNA分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶5′端高度甲基化，以限制性内切酶EcoRI、BamHI、HindⅢ、KpnI和PstI酶切ISKNV基因组DNA，经电泳分离后，分别得到1、8、9、18、22条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过108.7kbp。 相似文献
13.
为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为Ig G1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。 相似文献
14.
用超分支滚环扩增法检出传染性脾肾坏死病毒。超分支滚环扩增法包括锁式探针的连接及超分支滚环扩增法扩增两部分,通过研究锁式探针的最佳连接体系和连接条件,并进行超分支滚环扩增法反应条件的优化,得出的本研究最适反应条件为:锁式探针在T4 DNA连接酶作用下37℃连接20 min,接下来的超分支滚环扩增法在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应40 min,即能够实现靶序列的有效检出。灵敏度试验表明,超分支滚环扩增法所能检测到的最低模板量接近1 copy。在4种病毒中进行的特异性试验表明,本方法能够保证对传染性脾肾坏死病的特异性检测。 相似文献
15.
从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。 相似文献
16.
为建立传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)灭活快速检验方法,从ISKNV感染CPB细胞系转录谱筛选并经q RT-PCR验证表达量最高的病毒ORF099基因作为快速检测靶基因。以质粒p MDORF099为标准品,采用q PCR方法绘制了CT值与质粒拷贝数的标准曲线,其线性方程为CT=–3.42lgx+39.455,最低检测限为3拷贝/μL,结果显示组间和组内变异系数均小于2%,表明该方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。将ISKNV病毒悬液10倍稀释成100~103拷贝/m L,分别取1 m L病毒稀释液接种CPB细胞,在第7、9和11天提取细胞总RNA,经基因组DNA去除试剂盒去除残留DNA后采用qRT-PCR方法检测ORF099基因转录本,结果显示在第7天即可从接种1个拷贝病毒的细胞中检测出ISKNV ORF099转录本。将3个浓度梯度(0.05%、0.1%、0.2%)的甲醛灭活ISKNV制备的模拟样品以及实验室制备的3批次ISKNV细胞灭活疫苗样品接种CPB细胞9 d,采用上述快速检验方法进行检测。0.05%、0.1%甲醛灭活模拟样品可检测到ISKNV ORF099基因转录本,其他样品均未检测到。而细胞盲传实验显示,0.1%终浓度甲醛灭活ISKNV接种细胞盲传3代未出现CPE,鱼体安全实验显示接种鱼体后无临床发病症状和实验鱼死亡,表明本研究建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全实验具有更高的灵敏度,与传统检测方法相比具有灵敏度高、耗时短、检测效率高等优点,对提高ISKNV灭活疫苗生产效率具有重要意义。 相似文献
17.
18.
鳜传染性脾肾坏死病毒p31基因结构及序列分析 总被引：3，自引：0，他引：3
报道了鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的p31基因结构及其序列分析。对ISKNV DNA HindⅢE酶切片段的序列分析结果发现该序列中含有完整的p31基因，ISKNV p31基因完整读码框为675bp，GC含量为49.78%，等电点为7.61，编码一个长为225aa、分子量为25.3kD的推定蛋白。结果分析发现该基因具有启动动子TATAbox和CAATmotif，下游有反向重复序列可形成茎环，另外还有一段直接重复序列和二联体结构。ISKNV与其它3种虹彩病毒（包括FV3、LCDV－1和EHNV）的p31基因氨基酸序列具有一定的同源性，但ISKNV与它们的同源性不高，序列比较和系统树分析发现ISKNV与蛙病毒属和淋巴囊肿病毒属的病毒都不尽相同。 相似文献
19.
20.
为分离日本鳗鲡脾脏中的抗菌肽,实验采用10 ku和3 ku切向流中空纤维柱对脾脏醋酸粗提物进行分级分离,并结合阳离子交换层析和反相高效液相层析技术对小于10 ku和小于3 ku 2部分样品分别进行分离纯化。结果显示,2种分子量截留纤维柱超滤获得了大于10 ku、小于10 ku和小于3 ku 3部分样品。小于10 ku和小于3 ku蛋白样品抗菌活性较大于10 ku样品强。对小于10 ku样品经阳离子交换层析以及采用pH 9缓冲液进行反相高效液相层析分离纯化,获得一个抗菌肽,质谱分析其分子量为1 391.82 u;对小于3 ku样品经阳离子交换层析并采用pH 9和pH 2两种缓冲液进行反相高效液相层析分离纯化,获得一个抗菌肽,质谱分析其分子量为839.19 u。研究表明,日本鳗鲡脾脏中起抗菌活性的主要成分是一些小分子蛋白。 相似文献