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1.
王欢 《饲料博览》2021,(2):91-92
犊牛的呼吸道疾病属于常见传染性疾病,在养殖的过程中较为多发,导致疾病感染的原因也呈多样化的特点。在通常情况下,犊牛的呼吸道疾病主要是由于感染了多杀性巴氏杆菌、嗜血杆菌、溶血曼氏杆菌以及支原体等病原。由于犊牛的抵抗力较差,所以一旦感染了呼吸道疾病,会对犊牛的生长与存活率带来消极影响。犊牛的呼吸道疾病在流行病学调查过程中并不多见,所以一般致病的成因都被看作是由于病原的侵袭以及管理不当所引起的。病菌会对犊牛的免疫功能造成影响,再加上养殖环境较差,不仅会导致犊牛的代谢出现混乱,还会对其生命健康造成严重威胁。  相似文献   

2.
从一九八六年至一九八七年对我省黄犊牛腹泻病的流行病学、病原、临床诊断和治疗进行了比较系统的研究。调查1799头黄犊牛,发病1079头,发病率60.98%;死亡106头,死亡率5.89%;致死率9.66%。应用电镜观察51份腹泻犊牛粪样,30份有轮状病毒颗粒,检出率58.82%。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PACE)直接检验病毒核酸60份粪样,33份出现典型的轮状病毒核酸电泳图谱,检出率55%。二而符合率96%(48/50)。采用白痢散和犊痢汤配合补液纠酸等方法进行治疗试验,疗效显著。  相似文献   

3.
为了解宁夏地区新生犊牛腹泻(Neonatal calf diarrhea,NCD)相关病原的流行情况,应用PCR法分别对宁夏部分地区采集的195份2月龄内断奶前犊牛粪便进行NCD相关病原检测,并对主要病原进行遗传进化分析。结果表明,宁夏部分地区NCD主要发生于30日龄内的犊牛,牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV)、牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCoV)、牛诺如病毒(Bovine Norovirus,BNoV)和隐孢子虫是该地区引起NCD的主要病原,在腹泻犊牛中检出率分别为19.8%、9.43%、12.26%、6.6%。遗传进化分析表明,检出的BRV、BCoV与国内已报道的毒株遗传进化关系较近,BNoV主要为GⅢ.2型,隐孢子虫主要为微小隐孢子虫。上述结果表明,BRV、BCoV、BNoV和隐孢子虫是宁夏部分地区NCD的主要相关病原,其中BNoV已经在该地区新生犊牛中广泛流行。  相似文献   

4.
采取陕西省部分地区细菌性犊牛腹泻病料104份,进行病原细菌的分离鉴定,结果表明,引起该地区犊牛腹泻的细菌性病原主要是致病性大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、多杀性巴氏杆菌等;大肠杆菌主要以02、086、0138为优势血清型。根据抗生素及中药对分离菌的药敏试验结果,筛选出敏感中药并组方研制出”肠菌清散剂”进行临床防治试验,总有效率为88.9%。  相似文献   

5.
<正> 犊牛肠道疾病中,大肠杆菌病占居首位.Blood报道,死亡犊牛患大肠杆菌病的占28%.该病主要发生于未吃到初乳和一周龄以内的犊牛.临床症状分败血型、中毒型和肠炎型.以后者较为多见.其病原是一定血清型的肠毒原性大肠杆菌.致病的血清型近20余种,分属于下列O血清群:O_2、O_8、O_9、O_(15)、O_(20)、O_(25)、O_(26)、O_(35)、O_(41)、  相似文献   

6.
<正> 1987年3—4月初,河南省唐河县暴发犊牛腹泻病。应用电子显微镜技术,进行病毒RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(RAGE),ELISA试验,首次成功地从一月龄内腹泻犊牛的粪便中,检测出轮状病毒,经形态学,病毒RAN电泳分析,血清学鉴定,确认为典型的轮状病毒。是此次犊牛腹泻病的重要病原之一。 Mebus等1969年最早在美国内布拉斯加从患腹泻犊牛的粪便中分离到牛轮状病毒,命名为内布拉斯加。(Nebraska)犊  相似文献   

7.
犊牛大肠杆菌病又称犊牛白痢,主要发生于1周龄以内的犊牛。是由大肠杆菌引起的一种急性传染病,主要特征是腹泻与虚脱。病原由多种血清型的病原性大肠杆菌引起。临床症状1.败血型:潜伏期短,病初体温升高达40℃,精神沉郁,喜卧,后发生下痢、  相似文献   

8.
为了掌握规模奶牛场寒冷季节犊牛腹泻流行状况及其影响因素,课题组选择了6个奶牛场2月龄以内的1135头犊牛进行调查;分别从临床症状、发病情况和血液、粪便生化等4个方面进行调查研究。经调查:犊牛腹泻年均发病率为28.63%(325/1135),淘汰率12.31%(40/325)。10月至来年5月期间,发病犊牛数占全年发病数的96.15%(325/338);寒冷的12、1和2月份间发病率最高,发病数占总发病数的79.69%(259/325),1月份犊牛发病数占总发病数的32.30%(105/325);在冬春季节,饲养管理性腹泻占28.62%(93/325),传染性腹泻占71.38%(232/325)。血液生化血糖显著降低(P0.01),血钾显著升高(P0.05)。  相似文献   

9.
O78败血型犊牛大肠杆菌的分离和鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
从发病犊牛体内分离到一株病原细菌,经微生物学鉴定表明为O78血清型的败血型犊牛大肠杆菌。  相似文献   

10.
近年来,犊牛传染性肺炎的发病率逐渐提升,病原呈现出多元化的态势,预防难度及治疗难度有所增加。为了更好地防治犊牛传染性肺炎,应做好病原分析工作,筛选最佳的措施开展有效的防治工作。  相似文献   

11.
【目的】明确新疆北部棉花主要病原菌及其分布,为新疆棉花数据库的建立提供数据,为棉花主要病害的高效防控提供依据。【方法】针对棉花主要根茎部病害从新疆北部9个市县级(含附近团场)采样区域中广泛采集病株,利用4种病害(枯萎病、立枯病、黄萎病和红腐病)各自的病原菌的特异性引物进行PCR检测。【结果】从9个采样区域,共72份以村(连)为单位的混合病样中,普遍或较普遍地检测到4种病害的病原菌,但各病原菌检出率有较大差异。其中,尖孢镰刀菌的检出率较高,为84.72%;立枯丝核菌次之,为56.94%;大丽轮枝菌和串珠镰刀菌检出率相对较低,分别为45.83%和37.50%。【结论】在所有采样区域中尖孢镰刀菌及所引起的枯萎病分布最为普遍,立枯丝核菌及所引起的立枯病次之,2种病原菌及所致病害在各采样区域的大多数村(连)都有分布;大丽轮枝菌及所引起的黄萎病在各采样区域以及近半数的村(连)有分布,串珠镰刀菌及所引起的红腐病分布不广,有明显的区域性,仅个别采样区域有较高频的分布。  相似文献   

12.
新疆地区四种草莓病毒病原的检测   总被引:4,自引:0,他引:4  
【目的】研究新疆草莓病毒病病源种类及田间发生情况,建立主要病毒病原多重RT-PCR检测体系,为无病毒草莓生产提供理论和技术支持。【方法】利用已报道的4种草莓主要病毒病原4对特异性引物,分别对新疆主要草莓种植区采集表现疑似病毒病症状的草莓样品共450份,采用单一反转录PCR(RT-PCR)及多重PCR对采集的样品进行检测,分析新疆草莓病毒病的发生情况。【结果】感染新疆草莓有3种主要病毒,南北疆15个不同栽培区均能检测出这3种病毒,每个采集地的病毒检出率均在26%以上。所有样品中病毒总检出率为64.22%;其中,草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)检出率最高,为51.78%;草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)检出率为23.78%,草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)检出率为9.33%,草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)没有检出。病毒复合侵染率达18.45%,两种病毒病复合侵染检出率为16.67%,三种病毒病复合侵染检出率为1.78%;所有样品中对3种病毒的多重RT-PCR与单一RT-PCR检测结果一致。【结论】新疆草莓受SVBV、SMoV和SMYEV三种病毒危害,单一病毒病感染率以及两种以上病毒复合侵染侵染率都较高,在无病毒种苗的培育和生产中加强病毒检测。  相似文献   

13.
【Objective】 The viral disease is one of the major diseases of pepper production in Guangdong Province. The disease incidence is generally 5%-30% in the field, which can up to 100% in serious field. The objective of this study is to identify virus species infecting pepper in Guangdong Province, and to provide a theoretical basis for the prevention and control of pepper virus disease. 【Method】 From 2013 to 2016, a total of 125 susceptible pepper plant samples were collected from 8 major pepper growing areas of Guangzhou, Foshan, Huizhou, Jiangmen, Meizhou, Zhanjiang, Maoming and Shaoguan in Guangdong Province. Total RNA was extracted respectively from the leaves of 125 pepper samples. The 7 mixed samples collected from Maoming, Meizhou and Shaoguan were analyzed by small RNA deep sequencing. According to the results of small RNA deep sequencing analysis, two pairs of specific primers of each virus were designed to RT-PCR. The first pair of specific primers was designed according to the sequences of spliced gene fragments from small RNA deep sequencing. The second pair of specific primers was designed according to the conserved region sequences of viral genome in the GenBank database with the highest homology to sequences of spliced gene fragments from small RNA deep sequencing. Using disease samples RNA involved in small RNA deep sequencing as a template, the RT-PCR amplification was carried out with the two pairs of primers. Based on RT-PCR amplification results, the better pair of specific primers of each virus was selected. Furthermore, all 125 samples collected from Guangdong Province were subjected to detect viruses with the better pair of specific primers by RT-PCR. 【Result】 Fourteen viruses were identified in 125 samples collected from major pepper growing areas in 8 cities of Guangdong Province. According to the order of detection rate from high to low, they were Pepper mild mottle virus (PMMoV) (44.0%), Bell pepper endornavirus (BPEV) (32.8%), Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) (31.2%), Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) (29.6%), Pepper vein yellow virus 1 (PeVYV-1) (26.4%), Pepper veinal mottle virus (PVMV) (25.6%), Cucumber mosaic virus (CMV) (18.4%), Chilli ringspot virus (ChiRSV) (16.8%), Pepper vein yellow virus 6 (PeVYV-6) (16.8%), Potato virus Y (PVY) (15.2%), Capsicum chlorosis virus (CaCV) (14.4%), Broad bean wilt virus 2 (BBWV-2) (9.6%), Pepper cryptic virus 1 (PCV1) (8.8%), Tobacco mosaic virus (TMV) (4.0%). The detection rates of PMMoV, BPEV, TMGMV, ChiVMV, PeVYV-1 and PVMV were over 25%. PMMoV, ChiVMV and PVMV were widely distributed in Guangdong Province. PMMoV (except Maoming), ChiVMV (except Shaoguan) were detected in pepper producing areas of other 7 cities. PVMV was detected in pepper producing areas of 8 cities. According to detection rate and distribution range, it was concluded that PMMoV, ChiVMV and PVMV were the dominant viruses infecting pepper in Guangdong Province. The mixed infection phenomenon was common on peppers in Guangdong Province. The detection rate of mixed infection was up to 88.0% in 125 samples. Among them, the mixed detection rates of 2 kinds, 3 kinds, 4 kinds, 5 kinds, 6 kinds, 7 kinds and 8 kinds of viruses were 28.0%, 25.6%, 12.0%, 9.6%, 6.4%, 1.6%, 2.4%, respectively. So, 2 kinds and 3 kinds of viruses mixed infection were the main infection forms on peppers in Guangdong Province. 【Conclusion】 There are 14 kinds of viruses endangering pepper plants in Guangdong Province, among which PMMoV, ChiVMV and PVMV are the dominant viruses. The phenomenon of mixed infection is common. The main infection forms on peppers are 2 kinds and 3 kinds of viruses mixed infection in Guangdong Province.  相似文献   

14.
基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类   总被引:1,自引:1,他引:0  
【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)(44.0%)、甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)(32.8%)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)(31.2%)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)(29.6%)、辣椒黄脉病毒1(Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1)(26.4%)、甜椒斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(25.6%)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)(18.4%)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)(16.8%)、辣椒黄脉病毒6(Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6)(16.8%)、马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y,PVY)(15.2%)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus,CaCV)(14.4%)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)(9.6%)、辣椒隐症病毒1(Pepper cryptic virus 1,PCV1)(8.8%)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)(4.0%)。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMoV、ChiVMV和PVMV分布广泛,PMMoV除了茂名外,ChiVMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMoV、ChiVMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMoV、ChiVMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。  相似文献   

15.
为建立一种基于毛细管电泳技术,可同时高效地检测7种常见猪源性疫病(猪链球菌、猪瘟病毒、日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、猪轮状病毒、沙门氏菌)的高通量快速检测方法,本研究将多重PCR与毛细管电泳相结合,针对各毒株基因保守序列分别设计7对特异性引物,在每条引物的5'端加上通用引物标签序列,构成特异性嵌合引物。进行梯度PCR扩增以优化退火温度,使用正交试验以进行特异性嵌合引物浓度的优化。取107~10-1 copies·μL-1浓度梯度的标准品进行检测,以评价该方法的灵敏性。选取7种病原的DNA或cDNA,进行随机分组作为模板进行扩增,检测交叉反应性。以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、构建的非洲猪瘟质粒、大肠埃希菌等其他重要病原的DNA或cDNA进行扩增,评价该方法的特异性。使用梯度稀释的7重混合样品进行扩增,每个稀释度进行3次扩增,以评价该方法的重复性。结果显示:该方法的最优退火温度为58.3 ℃,对7种病原进行同时检出的检测限度为103 copies·μL-1,各种对照样品均出现了特异性峰值,并且所有的阴性对照样品均未扩增,也未出现交叉反应性,重复试验之间数据差异变化微小,63份临床样品检测结果与国标或行业检测标准的检测结果完全一致。以上实验结果显示,所建立的方法具有高通量、特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,有较高的临床应用价值。  相似文献   

16.
 针对云南省不同地区不同季节猪呼吸道疾病综合征进行流行病学调查,根据其临床特征,在不同规模养殖场共采集1164份血清样品,利用ELISA和RT-PCR方法检测其猪瘟抗原CSFV,猪繁殖与呼吸综合征抗原PRRSV,猪伪狂犬病PRV gE抗体及猪圆环病毒2型PCV-2特异抗体。结果表明:各季节和不同生长阶段猪群存在一种及两种以上的病毒混合感染,四重感染相对较少。从全年看单独感染占39.10%,PCV-2感染率最高,其次是PRV,PRRSV和CSFV;二重感染占26.13%,以PCV-2+PRV最常见,其次是PCV-2+ PRRSV、PRV+PRRSV;三重感染占8.05%,PCV-2+ PRRSV+PRV最常见;有四重感染出现,仅占1.57%。从季节来看,春季和夏季混合感染最高,分别为76.53%和60.74%,冬季和秋季的混合感染率分别为59.50%和53.55%。从年龄和性别看,育肥猪的混合感染率高于仔猪,分别为68.66%和61.11%,种公猪的感染率高于母猪,分别为70.00%和55.51%。说明4种病毒有单独感染或混合感染,推测其中PCV-2在混合感染中可能充当免疫抑制的角色,混合感染使PRDC症状更明显,死亡率增高。  相似文献   

17.
黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌及优势种分析   总被引:2,自引:1,他引:1  
【目的】 明确黄淮海夏玉米主产区玉米茎腐病的主要病原菌组成及优势种,为病原菌致病机制、抗性育种及茎腐病防治提供依据。【方法】 于2014—2017年采集黄淮海夏玉米主产区3个省(河北、河南、山东)的玉米茎腐病样本850份。通过形态学、通用引物和特异引物对病组织分离物进行鉴定,并采用上述引物直接检测病组织。整合分析分离物鉴定法和组织分子检测法的结果以确定玉米茎腐病的主要病原菌及优势种;分析主要病原菌在各省间以及同一省份不同年度的检出率,揭示主要病原菌的种群动态变化;分析单个样本中病原菌的检出率,探讨多种病原菌的共存模式。【结果】 有667份样本检测出真菌或卵菌,占总样本的78.47%;年度间样本检出率存在差异,2014年的检出率不足50%,而2015—2017年的检出率相近,均高于90%。在所有样本中共检出20属46种真菌或卵菌,其中镰孢菌(Fusarium spp.)的检出率最高,为89.96%,包括禾谷镰孢复合种(F. graminearum species complex)、层出镰孢(F. proliferatum)、拟轮枝镰孢(F. verticillioides)、厚垣镰孢(F. chlamydosporum)、亚粘团镰孢(F. subglutinans)、尖镰孢(F. oxysporum)、黄色镰孢(F. culmorum)、藤仓镰孢(F. fujikuroi)、变红镰孢(F. incarnatum木贼镰孢(F. equiseti)和茄镰孢(F. solani)11个种;腐霉菌(Pythium spp.)的检出率为34.18%,包括芒孢腐霉(P. aristosporum)、禾生腐霉(P. graminicola)、棘腐霉(P. acanthicum)、孤雌腐霉(P. amasculinum)和寡雄腐霉(P. oligandrum)5个种。拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢为4种主要病原菌,检出率依次为62.07%、46.93%、29.09%和28.04%,其中拟轮枝镰孢为优势种。各省之间,上述4种主要病原菌的检出率存在一定差异。拟轮枝镰孢在河北省的检出率为73.98%,明显高于该菌在河南省和山东省的检出率;禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率分别为35.78%和34.31%,均高于在其他两省的检出率。同一省份不同年度上述4种主要病原菌的检出率呈动态变化,其中任何一种病原菌均有可能上升为优势种。进一步分析表明,单个样本中可以检测出一种或多种病原菌,检测出1种菌的样本占38.38%,检出2种和3种病原菌的样本分别占29.24%和19.04%;2种及以上病原菌共存以镰孢菌和腐霉菌、镰孢菌和镰孢菌模式为主。【结论】 黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢,其中拟轮枝镰孢为优势种;拟轮枝镰孢在河北省的检出率最高,层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率最高,禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;单个样本中存在多种病原菌共存的模式。  相似文献   

18.
【目的】立枯病、红腐病、枯萎病和黄萎病是新疆棉花上的4种主要土传病害,研究4种病害的病原菌在新疆棉花上的侵染动态,分析各自的侵染始期和最佳防治时期,为病害高效防控提供依据。【方法】针对4种主要病害的病原菌,对混合接菌后分期采集的棉株进行特异性引物PCR检测,依据检测结果,进行各病原菌侵染动态分析及混合侵染分析。【结果】4种病原菌从棉花子叶期即能侵染;立枯丝核菌侵染相对较早、较快,拟轮枝镰孢霉次之;2种病原菌均在棉苗前期有较高的侵染株率,3叶期达到高峰,此后侵染株率逐渐降低;而尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌,虽从子叶期开始即可侵染,但侵染株率较低,直到蕾铃期侵染株率呈渐增趋势;病原菌之间的混合侵染普遍存在,以两菌混合侵染居多。【结论】子叶期为4种病原菌的侵染初期;立枯丝核菌和拟轮枝镰孢霉以苗期侵染为特点;尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌以子叶期到蕾铃期均可侵染为特点;病原菌之间常有混合侵染发生。  相似文献   

19.
【目的】研究引起石河子地区某养兔合作社兔不明原因大量死亡的主要病原菌及其耐药性。【方法】采用常规细菌分离培养、形态学观察、生化试验、PCR鉴定及荚膜血清分型、致病性试验、药敏试验明确主要致病菌及其生物学特性。【结果】引起此次疾病的主要病原为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌,且具有较强的致病性,并伴有大肠杆菌混合感染;临床常用的30种抗菌药物中较为敏感的是第三代头孢菌素类如头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟,部分喹诺酮类抗生素如氧氟沙星、左氟沙星以及氟苯尼考等敏感,对其余20余种药物中度敏感或耐药,分离菌株呈现出不同程度的多重耐药性。【结论】荚膜血清A型巴氏杆菌是引起石河子地区兔大规模死亡的主要病原菌,且对临床常用抗菌药物耐药严重;充实了巴氏杆菌在引起该地区引起多种动物疾病的研究基础,为指导临床科学用药和防控提供依据。  相似文献   

20.
【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株、猪A群轮状病毒(GARV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒(SADS-CoV)及猪捷申病毒(PTV)5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对 PEDV 多个基因型毒株ORF3基因比对分析,以PEDV野毒株为模板,对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针,并在两端保守区域设计上下游引物;在靠近GARV G3、G4、G5和G9型 NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针,并加入简并碱基。同时,分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针,用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化;用RStudio参照代码绘制ROC曲线,确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC,并计算Youden指数,最终确定检测临界值;从阳性核酸中扩增靶基因,并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录,获得5种标准品分别命名为:cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估;并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为:35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×102 copies/μL,标准曲线线性关系良好,扩增效率在96.3%—104%之间;该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.suis)和葡萄球菌(S.aureus)等多种菌毒株均不检出,具有良好的特异性;经重复性检验,组内变异系数在0.22%—3.08%之间,组间变异系数在0.89%—4.0%之间;对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较,符合率分别为:PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外,对临床样本检测结果显示,当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出;但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行,其总体阳性率分别达到:10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242),且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染,使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究,为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和 GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR,为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。  相似文献   

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