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1.
《畜牧与兽医》2015,(9):31-35
为了构建猪MEF2C基因的RNA干扰重组质粒,并筛选出最佳干扰效率的序列,本试验采用RNAi技术,设计并合成了3条针对猪MEF2C基因的RNA干扰序列,构建了RNA干扰重组质粒(命名为siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),将其转染到小鼠C2C12细胞,并用实时定量PCR检测细胞中MEF2C基因mRNA的表达,Western blot测定细胞中MEF2C基因蛋白的表达。结果表明:重组质粒经PCR扩增后显示产物大小与预期一致,产物经双酶切及测序鉴定该序列与NCBI提供的序列一致。重组质粒转染C2C12细胞后,MEF2C基因mRNA表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(33.67±2.51)%、(21.00±3.60)%、(71.67±4.04)%。Western blot结果表明MEF2C基因蛋白表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(47.33±0.05)%、(38.25±0.16)%、(67.27±0.12)%。本试验成功构建猪MEF2C基因干扰重组质粒,最终确定干扰质粒(siRNA-3)具有最佳干扰效果,证实MEF2C基因的干扰质粒能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为探讨该基因与肌肉肉质性状的关系提供理论基础。 相似文献
2.
《畜牧与兽医》2015,(1):76-81
为了获得稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞C2C12细胞株,将猪skMLCK基因cDNA序列T-A克隆至pMD-18T载体;重组质粒经双酶切后,定向克隆至真核表达载体,获得表达重组质粒pEGFP-N1-skMLCK;经脂质体介导,重组质粒稳定转染入C2C12细胞中;通过实时定量PCR方法检测skMLCK基因的表达水平,以及其他相关基因的表达情况。结果:获得了稳定表达猪skMLCK基因的C2C12细胞株;连续培养30d后,用实时定量PCR方法检测到skMLCK基因高表达,同时发现CFL2b和MEF2C基因表达下调。试验表明稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞系构建成功,为猪skMLCK基因功能的进一步研究提供了前期工作基础。 相似文献
3.
从猪的股二头肌中提取总RNA,利用RT-PCR技术从猪骨骼肌中获得CFL2基因的编码区序列,T-A克隆至PMD-18T载体,经HindⅢ和XhoⅠ酶切后定向克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)中。获得的重组质粒pCDNA3.1(+)/CFL2用限制性内切酶酶切分析和DNA测序分析鉴定,并经脂质体瞬时转染C2C12细胞,最后利用PCR检测转基因细胞中CFL2基因的存在及其表达情况。结果显示:猪CFL2基因已克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,转染的C2C12细胞中检测到细胞内较高量CFL2的表达。pCDNA3.1(+)/CFL2真核表达载体的成功构建,为深入研究CFL2基因在猪肌肉细胞中的功能奠定基础,为猪肉质品质的改良提供了新的思路。 相似文献
4.
猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
5.
《动物医学进展》2021,42(10)
为探究甲基转移酶样21C(methyltransferase like 21C,METTL21C)在小鼠成肌细胞分化过程中的功能,设计2组METTL21C的shRNA干扰序列,构建靶向METTL21C的干扰载体。用慢病毒法侵染小鼠C2C12细胞,筛选获得稳定干扰METTL21C的C2C12细胞株并检测干扰效率,经过20 mL/L马血清诱导细胞分化后用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测成肌分化相关基因表达。结果表明,成功构建两组靶向METTL21C的慢病毒干扰载体,实时荧光定量PCR及Western blot结果显示干扰组细胞中METTL21C表达水平均极显著降低(P0.01),shRNA1组干扰效率最高(73.6%)。干扰组细胞中成肌分化标志基因MyoG、MyoD、Myf5、MRF4表达水平均极显著降低,MEF2C表达水平下调更为明显(P0.01)。慢肌标志基因MYH7表达水平也极显著降低(P0.01)。说明METTL21C促进小鼠成肌细胞分化,其通过调控MEF2的表达影响MRFS家族基因从而影响成肌分化。 相似文献
6.
猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究 总被引：5，自引：2，他引：3
为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。 相似文献
7.
《畜牧与兽医》2015,(9):80-83
利用免疫共沉淀技术验证丝切蛋白(CFL2)和肌细胞增强因子-2(MEF2C)之间的相互作用关系。构建带绿色荧光蛋白(GFP)的p EGFP-N1-CFL2和p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP-his-MEF2C重组载体,经双酶切鉴定正确后,分别将上述重组载体共转染至人宫颈癌细胞(Hela),利用免疫共沉淀方法验证CFL2和MEF2C之间的相互作用关系。结果表明,p EGFP-N1-CFL2和p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFPhis-MEF2C重组载体共转染Hela细胞,分别用抗CFL2和抗MEF2C抗体沉淀蛋白复合物,用MEF2C和CFL2抗体进行Western blot检测,检测到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP-his-MEF2C和p EGFP-N1-CFL2的表达。本试验成功构建p EGFP-N1-CFL2和p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP-his-MEF2C真核表达重组载体,在Hela细胞中表达后利用免疫共沉淀的方法证实了CFL2和MEF2C之间存在相互作用。 相似文献
8.
禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性. 相似文献
9.
利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。 相似文献
10.
通过构建猪核转录因子C/EBPβ编码区真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,将猪C/EBPβ异位表达于小鼠成肌细胞C2C12细胞中,为进一步研究C/EBPβ在猪脂肪发育中的调控机制奠定基础。本试验利用RT-PCR扩增C/EBPβ编码区序列并测序,提交GenBank;并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过双酶切和测序鉴定重组质粒。将重组表达体pEGFP-N1-C/EBPβ导入C2C12细胞,荧光显微镜下观察C/EBPβ在细胞中的定位,半定量RT-PCR和Western blot检测C/EBPβ在细胞中的表达情况。本试验成功克隆测序了猪C/EBPβ基因编码区序列,并首次上传到GenBank;成功构建猪C/EBPβ真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,并将其异位表达。结果表明:猪C/EBPβ在脂肪组织中表达量丰富,心肌和背最长肌表达微量,并且正确插入真核表达载体pEGFP-N1,荧光显微镜下观察重组体组主要集中在细胞核;而C/EBPβ基因和蛋白在转染重组体C2C12细胞中均有表达。本研究为提高猪肉肌内脂肪含量方面的研究提供新的思路。 相似文献
11.
研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1（UCP1）基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据。用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度（0、5、20、50和100 μg/mL）鞘磷脂对C2C12细胞增殖和毒性的影响,并通过形态学观察和分化前后细胞成肌分化标记基因生肌因子5（Myf5）、生肌决定因子（MyoD）、肌细胞生成素（Myogenin）、生肌调节因子4（MRF4）的表达检测,建立C2C12成肌分化体系;在成肌分化培养基中添加上述不同浓度的鞘磷脂,诱导分化6 d后,通过形态学和Myogenin免疫荧光染色观察肌管的形成及成肌分化标记基因的mRNA表达水平检测,确定鞘磷脂的最佳添加浓度。用筛选出的最佳鞘磷脂添加浓度诱导细胞成肌分化,在2、4和6 d收集细胞,利用实时荧光定量PCR检测周期蛋白相关基因CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表达水平,CCK8法检测诱导2 d细胞的活力。结果发现,与野生型猪相比,UCP1-KI猪背部肌肉组织中总鞘磷脂含量显著增加（P<0.05）;血清鞘磷脂含量差异不显著（P>0.05）;不同浓度鞘磷脂对未分化C2C12细胞的增殖无显著影响（P>0.05）;成肌分化6 d后,C2C12细胞形成明显的肌管,成肌分化标记基因Myf5、MyoD、Myogenin、MRF4的mRNA和蛋白水平均极显著上调（P<0.01）;与未添加鞘磷脂的对照组相比,20 μg/mL鞘磷脂组有更多肌管形成,Myogenin阳性信号和肌管融合指数均显著增加（P<0.05）,Myogenin、MRF4基因的表达量显著提高（P<0.05）。利用20 μg/mL鞘磷脂诱导细胞分化,在分化2 d时,处理组CyclinE、CDK4基因表达量显著高于对照组（P<0.05）,细胞活力也显著高于对照组（P<0.05）;分化6 d后,处理组CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4基因表达量均显著低于对照组（P<0.05）。本研究结果表明,20 μg/mL鞘磷脂能够提高小鼠肌卫星细胞C2C12分化早期细胞活力和成肌分化效率,可为研究鞘磷脂对骨骼肌生长的影响提供一定的参考。 相似文献
12.
【目的】为了揭示地锦草(EH)在猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中的抗炎和抗氧化作用。【方法】利用不同浓度EH水提物(0、5、10、50、125、200μg/mL)处理IPEC-J2细胞12 h,通过CCK-8法检测IPEC-J2细胞活力,确定EH处理细胞的最佳浓度。将IPEC-J2细胞随机分为对照组(CT)、脂多糖(LPS)组(LPS)、EH+LPS组(ELP),每组3个重复。CT组细胞正常培养不做任何处理,LPS组细胞用5μg/mL LPS处理,ELP组细胞用5μg/mL LPS和最佳浓度EH共处理,各组细胞均处理12 h后,收集细胞和上清。利用实时荧光定量PCR方法检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)mRNA表达;ELISA法检测上清液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,化学荧光法检测上清液中活性氧(ROS)水平。【结果】与0μg/mL EH组相比,5、50μg/mL EH组IPEC-J2细胞... 相似文献
13.
旨在研究全羧化酶合成酶（holocarboxylase synthetase,Hlcs）对糖酵解基因表达的影响,为进一步研究细胞糖酵解奠定基础。本试验以C2C12细胞为试验材料,采用siRNA技术干扰Hlcs基因,通过荧光定量PCR和Western blotting检测Hlcs基因干扰对糖酵解基因表达的影响。结果表明,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与Pfkm、Pkm、Hk-2基因的表达趋势一致,提示Hlcs基因与糖酵解具有相关性。干扰Hlcs后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,糖酵解限速酶Pfkm的mRNA水平显著降低（P<0.05）,而显著提高了Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平（P<0.05）;生物素作为羧化酶的辅酶,能够显著上调Pkm、Hk-2的mRNA水平（P<0.05）。干扰Hlcs后,细胞分化形成的脂滴数量明显少于对照组,Pfkm的mRNA水平显著升高（P<0.05）,且Pkm的mRNA水平和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;生物素的添加能够显著上调Pfkm、Pkm的mRNA水平（P<0.05）。综上所述,在C2C12细胞分化过程中,Hlcs基因与糖酵解基因表达趋势一致,且干扰Hlcs基因可以抑制成肌分化C2C12细胞中Pfkm和Hk-2基因的表达,促进Pkm的表达;而促进成脂分化C2C12细胞中Pfkm和Pkm的表达,抑制Hk-2基因的表达。 相似文献
14.
本研究分析了共轭亚油酸(CLA)对C2C12肌细胞生脂转分化和生肌分化的影响。分别培养并诱导C2C12鼠源肌细胞生脂转分化和正常的生肌分化,同时分别使用终浓度为50μmol/L的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA处理细胞,并设对照组,取生脂转分化第10天和生肌分化第8天的细胞用于实时定量PCR检测,观察c9,t11-CLA和t10,c12-CLA对C2C12肌细胞不同分化的影响。结果表明:1)与对照组相比,c9,t11-CLA促进了C2C12肌细胞的生脂转分化,显著增加了细胞内甘油三酯(TG)含量(P0.05),显著上调了细胞内脂肪酸合成酶(FAS)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因的表达水平(P0.05);与对照组相比,t10,c12-CLA则抑制了C2C12肌细胞的生脂转分化,显著减少了细胞内TG含量(P0.05),显著下调了细胞内C/EBPα、PPARγ和FA BP4基因的表达水平(P0.05)。免疫印迹杂交结果显示FAS和FABP4的蛋白质表达水平也发生了与基因表达相一致的变化。2)与对照组相比,t10,c12-CLA抑制了C2C12肌细胞的生肌分化,显著减少了细胞内肌管数/细胞数(P0.05),显著下调了细胞内肌细胞生成素(MYOG)和成肌分化抗原(MYOD)基因的表达水平(P0.05);与对照组相比,c9,t11-CLA则显著上调了细胞内MYOG基因的表达水平(P0.05),对C2C12肌细胞的生肌分化有一定程度的促进作用。免疫印迹杂交结果显示MYOG和MYOD的蛋白质表达水平也发生了与基因表达相一致的变化。以上结果表明,CLA对动物骨骼肌细胞的正常生肌分化和生脂转分化都具有重要的调节作用。 相似文献
15.
柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。 相似文献
16.
【目的】试验旨在探究circRNA-Zfp609调节C2C12成肌细胞增殖和分化的潜在分子机制。【方法】利用RT-PCR和测序分析小鼠骨骼肌组织和C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、骨骼肌组织及增殖12、24、36、48 h和分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的相对表达量;实时荧光定量PCR检测分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中肌细胞生成素（MyoG）和肌球蛋白重链（MyHC）的相对表达量。用circRNA-Zfp609的干扰表达载体（siRNA）干扰细胞,通过CCK-8测定siRNA对C2C12成肌细胞增殖率的影响;用实时荧光定量PCR检测siRNA干扰对circRNA-Zfp609、MyoG和MyHC相对表达量的影响。通过TargetScan 7.0和miRDB软件预测circRNA-Zfp609上与肌肉分化相关的miRNA位点,将筛选的miRNAs的过表达载体转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609与miRNA的互作关系。根据miRNAs对circRNA-Zfp609的互作,构建circRNA-Zfp609的野生型和突变型载体并转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609对miRNA的靶向关系。【结果】PCR和测序结果表明,小鼠骨骼肌中可表达circRNA-Zfp609;circRNA-Zfp609在小鼠骨骼肌中表达水平最高,在其他组织中的表达量由高到低依次是肾脏、肺脏、心脏、肝脏、胃、脾脏和小肠。与12 h相比,在C2C12成肌细胞增殖的36和48 h circRNA-Zfp609的相对表达量显著增加（P<0.05）;与分化第0天相比,在C2C12成肌细胞分化的第1、3和5天circRNA-Zfp609的相对表达量均显著增加（P<0.05）,MyoG、MyHC的相对表达量均极显著增加（P<0.01）。与NC组相比,siRNA组C2C12成肌细胞的增殖率和circRNA-Zfp609相对表达量均极显著降低（P<0.01）,MyoG和MyHC的相对表达量显著降低（P<0.05）。circRNA-Zfp609上有miR-150-5p、miR-327、miR-344g-3p和miR-615-5p 4种与肌肉分化相关的miRNAs。circRNA-Zfp609与miR-615-5p的吸附能力最强,具有靶向结合作用。circRNA-Zfp609可以作为分子海绵与调控肌肉分化相关的miR-615-5p相互作用。【结论】circRNA-Zfp609在小鼠的组织中广泛表达,在骨骼肌中表达水平最高;circRNA-Zfp609在C2C12成肌细胞增殖和分化的不同时期差异表达,circRNA-Zfp609上有4个与肌肉分化相关的miRNAs,其中miR-615-5p与circRNA-Zfp609具有靶向关系。本研究结果可为与家畜骨骼肌生长发育相关的研究提供参考。 相似文献
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本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件，为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒，对接毒时细胞维持液中胰酶浓度（0、2、4、6、8和10 μg/mL）、细胞密度（40%、60%、80%、100%、200%）、接毒剂量（MOI分别为1、0.1、0.01和0.001）、吸附时间（0、30、60、90、120、240 min）、收毒时间（接毒后12、24、36、48、60、72 h）、维持培养温度（35、36、37和38 ℃）和转瓶转速（6、8、10、12、14、16 r/h）7个条件进行优化。结果显示，PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为：细胞刚铺满单层时接毒，接毒量为MOI=0.01，维持液（无血清DMEM培养液）中胰酶质量浓度为6 μg/mL，不需吸附，维持培养温度为37 ℃，12 r/h 旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液，效价可稳定达到106.50 TCID50/0.1 mL。本试验为 PEDV 变异株大量培养提供了参考，为变异株疫苗研发奠定了基础。 相似文献
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利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的ORF2基因与T细胞表位（T cell epitope,TCE）基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头（Gly4Ser）3为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子（Gly4Ser）3进行融合连接。将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE,将该重组质粒用PmeⅠ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（内含pAdEasy-1骨架质粒）进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE。PacⅠ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为1012.3 TCID50/mL。Western blotting及间接免疫荧光试验（indirect immunofluorecent assay,IFA）结果表明融合蛋白得到正确表达。 相似文献