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根际土壤微生物DNA提取及纯化方法的比较 总被引：7，自引：0，他引：7
本文采用了四种方法对红松和长白赤松土壤根际土壤微生物DNA进行了提取,同时分别采用了三种方法对所提取的根际土壤微生物粗DNA进行了纯化,并且对不同的提取和纯化方法进行了比较和评价。结果表明:对根际土壤微生物总DNA提取效果最好的是,以SDS为基础的含有1.0%(w/v)的高浓度NaCl的蛋白酶K法。这个方法可有效地去除腐殖酸和其它杂质。由于透析法能够积极有效地去除粗DNA中的棕色物质和腐殖酸,所以非常适合纯化根际土壤微生物DNA,而且纯化产物进行PCR扩增时效果很好。此外,挤胶法由于其经济有效的优点,所以也是一个很好的纯化根际土壤微生物粗DNA的方法。 相似文献
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【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫 DNA 的方法。【方法】运用 Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫 DNA 的方法,并通过普通 PCR 与环介导等温扩增( LAMP)对提取的 DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫 DNA 的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%( W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的 CTAB法和蛋白酶 K 法比较,Chelex-100法提取的 DNA得率高,相同条件下,该方法提取的 DNA浓度远远大于常规方法。3种方法的 OD260/280比值从大到小依次为CTAB法＞蛋白酶K法≥Chelex-100法,Chelex-100法的OD260/280值显著低于CTAB法,而略低于或等同于蛋白酶K法,但这并不影响对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。采用 Chelex-100法提取松木中松材线虫的 DNA,结合常规的PCR和 LAMP检测,检测灵敏度高,特异性强,稳定性好;提取的松材线虫 DNA 的75倍稀释液再稀释32倍后进行PCR扩增,扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的 DNA 后进行检测,所有带病松木样品的检测结果均呈阳性,而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外,该提取方法简便快速,20 min内即可完成整个 DNA的提取;经济方便,试剂保藏无特殊要求,单个样品提取耗费低于3.5元。【结论】Chelex-100法是一种快速有效的提取松木中松材线虫DNA的方法,此方法结合PCR和LAMP检测技术将进一步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性,可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。 相似文献
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不同提取方法的铁线莲属叶片总DNA提取效果 总被引：1，自引：0，他引：1
以铁线莲属植物的叶片为材料,采用CTAB-SDS法、简易CTAB法、改良CTAB法等3种提取方法,比较耗时、纯度、得率、浓度和质量等指标,以期为铁线莲属植物叶片总DNA的提取筛选适宜方法.结果表明,在纯度和浓度方面CTAB-SDS法＞简易CTAB法＞改良CTAB法,在节省提取时间方面改良CTAB法＞CTAB-SDS法＞简易CTAB法.以CTAB-SDS法所提取的9种铁线莲DNA为模板,进行PCR扩增,CTAB-SDS法提取的DNA得率高、质量好,PCR扩增成功率也较高.综合比较,采用CTAB-SDS法进行铁线莲属叶片总DNA提取效果更佳. 相似文献
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[目的]评价转基因库安托杨可能引起的生态风险。[方法]利用PCR扩增研究外源基因水平转移情况,利用稀释平板法研究土壤中细菌、真菌和放线菌数量。[结果]电泳结果显示:林下杂草混合样品和土壤微生物DNA样品中均未出现目的基因片段。转基因株系和非转基因株系的非根际土壤中可培养的细菌、真菌和放线菌数量在杨树的不同生长期出现一定的变化,但是这种变化没有明显的规律。[结论]8年生转基因库安托杨未出现外源基因水平转移,也未对土壤微生物的数量产生显著影响。 相似文献
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四种桉树青枯菌DNA提取方法及PCR检测灵敏度比较 总被引：2，自引：0，他引：2
以带有青枯菌Ralstonia solanacearum的桉树组织为材料,采用4种不同的提取方法抽提青枯菌DNA,同时利用青枯菌的特异性引物进行PCR扩增,比较了4种DNA的提取方法及PCR检测的灵敏度。结果表明,煮沸法和热裂解法操作相对简单,但检测灵敏度较低,检测限分别为104CFU/mL和103CFU/mL;简化提取法和试剂盒法检测效果较好,均可检测到102CFU/mL的青枯菌;简化提取法比试剂盒法操作更简单,检测成本低,具有更高的应用价值。 相似文献
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金叶含笑叶片基因组DNA提取方法的比较 总被引：2，自引：0，他引：2
以金叶含笑叶片为实验材料,分别采用CTAB法、改良CTAB法、简易提取方法、高盐沉淀法和SDS法5种方法提取金叶含笑叶片的基因组DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计及ISSR扩增3种方法对所提取的DNA样品进行检测.DNA纯度、含量比较以及扩增结果表明:5种方法中简易提取法和SDS法提取的DNA纯度较高.高盐沉淀法得到的DNA产量较高.5种方法提取的DNA用于ISSR扩增,其扩增结果基本一致.简易提取方法操作简单.省时省力,是用于ISSR扩增的金叶含笑基因组DNA提取的最佳选择. 相似文献
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土壤微生物多样性的分子生态学研究方法 总被引：2，自引：0，他引：2
传统的平板培养法分离培养和鉴定土壤微生物只能反映极少数微生物的信息,种类只占土壤微生物种类总数的0.1%～1%,分子生态学方法应用于土壤微生物的鉴定显示出极大的优越性.着重阐述了土壤微生物多样性的研究内容、意义及目前的采用分子生态学的方法研究土壤微生物多样性,尤其以DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）分子生物学技术以及RAPD（Random amplified polymorphic DNA ）随机扩增的多态性分析方法更为精确和快速,为土壤微生物多样性研究提供了一个更加广阔的前景. 相似文献
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分析了ISSR-PCR体系中Mg2+、dNTP和BSA浓度,以及模板DNA、引物和TaqDNA聚合酶用量等6个因素对反应结果的影响,建立了适合于台湾水青冈ISSR-PCR扩增的反应体系:10μL PCR反应液中,含10 ng DNA,1.5 mmol.L-1Mg2+,0.125 mmol.L-14×dNTP,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.6 UTaqDNA聚合酶,2 mg.mL-1BSA和3pmol引物。应用优化的ISSR-PCR体系从100个ISSR引物中筛选出12个稳定性好,重复性高的引物,对22株台湾水青冈个体的DNA进行扩增,结果表明优化的ISSR-PCR体系完全适合于台湾水青冈的ISSR分析。 相似文献
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The possible horizontal transfer of transgenes is of great concern when the transgenic plants are released into the field. To test the possible transfer of nptⅡ of transgenic trees into soil bacteria, we have used a stool DNA preparation kit to isolate the DNA from the soils in the rhizospheres of two non- and eight transgenic Eucalyptus camaldulensis trees. All the samples have provided the corresponding PCR products in the amplification with bacterial 16S RNA specific sequences, which indicates that the quality of the isolated DNA is adequate for amplification. The nptⅡ specific band has been amplified in three soil samples from the transgenic trees and even treated with filtration before the DNA isolation. This indicates that nptlI DNA exists in the soil, although it is still unclear whether the DNA was in the soil particles, in the soil bacteria or in the Agrobaeterium contamination which was used for the E.camaldulensis transformation. Two approaches on isolation of bacterial DNA have been suggested for testing the possibility of this event in the future. 相似文献
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以山茶基因组DNA为材料,测试山茶ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA量,Mg2+浓度,dNTP浓度,BSA浓度,引物用量,Taq酶用量等6个因素对山茶ISSR扩增的影响。结果显示:山茶ISSR扩增的最适退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris.HCl pH 9.0,50mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),2 mmol.L-1MgCl2,0.6 mmol.L-14×dNTP,2 mg.ml-1BSA,16 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。 相似文献
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Katsuaki ISHII 《中国林学(英文版)》2008,10(2):134-136
The possible horizomal transfer of transgenes is of great concern when the transgenic plants are released imo the field. To test the possible transfer of nptII of transgenic trees into soil bacteria, we have used a stool DNA preparation kit to isolate the DNA from the soils in the rhizospheres of two non- and eight transgenic Eucalyptus camaldulensis trees. All the samples have provided the corresponding PCR products in the amplification with bacterial 16S RNA specific sequences, which indicates that the quality of the isolated DNA is adequate for amplification. The nptⅡ specific band has been amplified in three soil samples from the transgenic trees and even treated with filtration before the DNA isolation. This indicates that nptII DNA exists in the soil, although it is still unclear whether the DNA was in the soil particles, in the soil bacteria or in the Agrobacterium comamination which was used for the E. camaldulensis transformation. Two approaches on isolation of bacterial DNA have been suggested for testing the possibility of this event in the future. 相似文献
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枣叶片DNA的提取以及AFLP反应体系的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
扩增片断长度多态性(AFLP)实验过程中,DNA提取质量和适合的PCR扩增反应体系是2个关键因素.利用CTAB法对枣树叶片DNA的提取方法进行探讨.结果表明:改良CTAB法抽提到了较高质量的枣基因组DNA,可用于AFLP实验分析;通过对酶切-连接体系和PCR扩增体系中的关键因素实验分析,建立了适合枣AFLP荧光反应体系,并得到清晰的DNA指纹图谱. 相似文献
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D. J. Than K. J. D. Hughes N. Boonhan J. A. Tomlinson J. W. Woodhall S. E. Bellgard 《Forest Pathology》2013,43(4):324-330
Kauri Agathis australis, an iconic tree of New Zealand, is under threat from an introduced disease‐causing pathogen provisionally named Phytophthora ‘taxon Agathis’ (referred to as PTA). This soilborne, Pythiaceous species belongs to the Chromista and causes a collar rot resulting in yellowing of the foliage and thinning of the canopy, which eventually causes death of the infected tree. The management and containment of this pathogen requires rapid and reliable detection in the soil. The current method for soil detection utilizes a soil bioassay involving lupin baits and soil flooding in a process that takes between ten and twenty days. We describe a real‐time PCR assay based on TaqMan chemistry for the specific detection of PTA, which targets the internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal DNA. This TaqMan real‐time PCR assay could be used with DNA extracted directly from bulk soil samples to enable rapid quantification of PTA within soil. The detection limit was 2 fg of PTA DNA from pure culture, or 20 fg in the presence of DNA extracted from soil. The assay was validated using soil samples taken from a PTA‐infested site and soil spiked with a known concentration of oospores. We conclude that the TaqMan real‐time PCR assay offers a more time‐efficient method for detection of PTA in soil than existing methods. 相似文献
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无患子总DNA提取方法研究 总被引：3，自引：2，他引：1
针对无患子富含多酚、多糖、蛋白质及其他次生代谢物质的特点,以无患子叶片为材料,分别采用改良的CTAB法和CTAB与SDS相结合法提取不同种源无患子的总DNA。结果显示,改良的CTAB法提取的总DNA,得率较高,纯度好,可用于酶切、PCR扩增等后续试验,并能获得清晰、稳定的扩增产物。而采用CTAB与SDS相结合的方法得到的基因组DNA效果不稳定,无法检测出DNA。改良的CTAB法具有简单、经济的特点,可用于无患子总DNA的提取,成功地进行SRAP分子标记分析,为研究无患子遗传资源多样性奠定基础。 相似文献