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1.
应用RT-PCR技术从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明,克隆得到的IL-4基因开放阅读框由396个核苷酸组成,编码一个由132个氨基酸组成的多肽,包括编码24个氨基酸的信号肽和108个氨基酸的成熟肽。与GenBank中已登录的大熊猫IL-4（DQ166512）的核苷酸序列同源性分别为99.5%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-4核苷酸同源性为50.7%（鼠）～87.7%（犬）;IL-4编码氨基酸同源性在35.7%（鼠）～78.8%（犬）;进化树构建结果表明,大熊猫与犬、猫遗传距离最近。 相似文献
2.
广西巴马小型猪IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析 总被引：6，自引：0，他引：6
为研究猪白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10）在机体免疫应答中的作用,从ConA刺激的巴马小型猪的外周血淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出IL-4和IL-10基因,将其分别克隆到PMD18-T 载体上,进行序列分析.结果表明,克隆的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列与GenBank上登录的其它猪种的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%～100%、97.0%～99.3%和99.2%、97.7%. 相似文献
3.
克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因,并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA,将其克隆到pMD18～T载体上,测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列,序列分析表明,克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％,与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因,其ORF为408bp,推导编码135个氨基酸。 相似文献
4.
猪Toll样受体2基因的克隆和序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究从猪肠系膜淋巴细胞中，克隆了猪Toll样受体2基因（pTLR2）。基因序列分析表明，克隆的pTLR2基因ORF为2358bp，编码785个氨基酸，合15．01％的亮氨酸，合有一段21个氨基酸的信号肽序列；与GenBank中登录的pTLR2序列（NM213761）的同源性为99．2％；与牛、马、绵羊和人的同源性较高，与家鼠、中国仓鼠相比次之．而与鱼类的最低。蛋白分子结构预测表明，该分子由胞外区（588个氨基酸）、跨膜区（23个氨基酸）和胞内区（174个氨基酸）组成，其胞外结构域由多个串联重复的LRR基序（XLXXLXLXX）组成，而胞内区合有与人白细胞介素1受体（IL-1R）高度同源的区域即TOLL／IL-1受体同源区（TIR），说明pTLR2分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用，这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。 相似文献
5.
猪白细胞介素-12的分子克隆与序列测定 总被引：5，自引：0，他引：5
为研究白细胞介素-12在机体免疫应答中的作用。从猪外周血提取单个核细胞（PBMCs)，用含LPS的培养基培养细胞，从培养2h和12h的活化细胞中分别提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出编码猪IL-12两个亚基的基因，其大小分别为720bp(P35)和1044bp(P40)，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化，用SacI和SalI双酶切后，分别将其连接至pUC18质粒上，进行质粒PCR和SacI,SalI双酶切鉴定后筛选阳性克隆，并进行序列测定和分析，序列分析表明P35基因开放阅读框含有669个核苷酸，序列与人，小鼠和羊同源性分别为79.2%,37.6%,86.1%,P40基因开放阅读框含有975个核苷酸，与人和小鼠，羊基因序列的同源性分别为79.5%,53.1%,84.3%。结果表明克隆到了猪白细胞介素-12P35和P40两个亚基的基因，得到的P35基因序列与国外报道完全一致，P40基因序列与发表的序列有4个碱基差异，提示P40基因可能存在多态性。 相似文献
6.
猪IL-2基因的克隆、序列分析及其杆状病毒表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列设计1对引物,将猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆到pGEM-TEasy载体上并测序.测序结果显示,克隆的猪IL-2 cDNA全长为516 bp,开放阅读框(ORF)包含465 bp,编码154个氨基酸,相对分子质量为17 400,等电点为5.27,此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%.与猫、牛、鸡、犬、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%、82.6%、28.2%、80.6%、29.6%、83.4%、81.3%、82.0%和61.5%.将此IL-2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual后获得了重组质粒pFBD-IL2,进而转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到了含猪IL-2基因的重组DNA,将其命名为Bacmid-IL2.本试验为进一步在昆虫细胞中表达猪IL-2基因、开发研制新型免疫佐剂奠定了基础. 相似文献
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8.
为探究山羊白介素10（interleukin 10,IL-10）基因的序列特征及在组织中的相对表达情况,试验采用PCR法扩增并克隆金堂黑山羊IL-10基因,用DNAMAN、DNAStar、ExPASy等生物信息学软件进行序列分析,运用实时荧光定量PCR法检测IL-10基因在金堂黑山羊不同组织中的表达情况。结果显示,金堂黑山羊IL-10基因序列长为379 bp,开放阅读框为276 bp,编码91个氨基酸残基。IL-10蛋白二级结构中含有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,分别为76.92%、2.20%和20.88%。IL-10蛋白三级结构模型与人IL-10（1ilk.1.A）基因同源性最高（86.81%）。系统进化分析结果发现,金堂黑山羊IL-10基因与挪威山羊IL-10基因亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测发现,在金堂黑山羊肺脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏、肌肉和肾脏（P<0.05）,在肾脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏和肌肉（P<0.05）,在脾脏、心脏和肌肉中IL-10基因表达水平较低,但差异不显著（P>0.05）。本试验结果揭示了IL-10基因具有高度的保守性,可能参与调控山羊的免疫应答反应。 相似文献
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荣昌猪白细胞介素-2和白细胞介素-4基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将荣昌猪外周血淋巴细胞在刀豆素A(ConA)的刺激下培养24~70 h后,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-4(IL-4)cDNA,克隆到pMD18-T载体并测序。结果表明:克隆的IL-2 cDNA全长为522个碱基,ORF为465个碱基,编码154个氨基酸,与GenBank公布的猪IL-2比对同源性均为99.8%;克隆的IL-4 cDNA全长411个碱基,ORF为402个碱基,编码133个氨基酸,与GenBank公布的猪IL-4比对同源性均在98.0%以上,从而证实成功克隆了荣昌猪IL-2和IL-4基因cDNA。 相似文献
10.
将本地沼泽型成年水牛外周血单核细胞(PBMC)在刀豆素A(ConA)的刺激下体外培养,提取培养的单核细胞总RNA,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增水牛白细胞介素-10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ),并克隆到pMD18-T载体上,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定筛选阳性克隆,然后进行测序。序列分析结果显示:IL-10开放阅读框(ORF)由536个核苷酸组成,共编码178个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IL-10基因的同源性为75.9%～99.6%;氨基酸的同源性为74.2%～100%。IFN-γ的ORF由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IFN-γ基因的同源性为60.7%～99.6%;氨基酸的同源性为40.6%～100%。 相似文献
11.
杂交猪白细胞介素-18全基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18(IL-18)全基因的cDNA,其大小为579bp,编码192个氨基酸。与GenBank上已发表猪IL-18序列(ABO10003)进行比较,核苷酸同源性为99.8%,在第550位处(以ATG为1计)由A→G,存在有意义突变。与GenBank上的ABO10003、AF176949、AY262109、NM1997序列进行比较分析,氨基酸同源性分别为99%,98.5%,99.8%和99%。从系统进化树可以看出,河南良杂猪IL-18基因与ABO10003、AY262109亲缘关系最近。河南良杂猪IL-18基因和人及其他动物IL-18基因核苷酸序列进行比较分析,结果显示猪与人、猫、牛、鸡、鸭、海豚、山羊、马、家鼠、老鼠、绵羊的IL-18基因核苷酸同源性分别为83.1%、88.3%、90.7%、26.8%、31.4%、26.3%、90.0%、91.5%、67.7%、65.1%和90.8%。 相似文献
12.
猪白细胞介素-4基因的克隆与表达 总被引：1，自引：2，他引：1
利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础. 相似文献
13.
Muneta Y Kikuma R Uenishi H Hoshino T Yoshihara K Tanaka M Hamashima N Mori Y 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2004,66(3):269-275
A pig interleukin-21 (IL-21) cDNA was successfully cloned and sequenced from porcine peripheral blood lymphocytes (PBL) stimulated with 10 microg/ml concanavalin A (ConA), 10 microg/ml phytohemagglutinin P (PHA), 50 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), and 0.5 microg/ml anti-porcine CD3 antibody for 48 hr. The open reading frame of the porcine IL-21 cDNA is 459 base pairs in length and encodes 152 amino acids. The predicted amino acid sequence of the porcine IL-21 shows 86.2%, 77.7%, and 58.4% identity to the bovine, human, and murine IL-21, respectively. The porcine IL-21 gene was mapped to porcine chromosome 8 (8q22-->q23) by means of fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping, where the porcine IL-2 gene had been mapped nearby. The recombinant porcine mature IL-21 expressed by E. coli induced dose-dependent proliferation and IFN-gamma production from a human NK cell line, NK0. The porcine IL-21 identified in this study will be helpful for the enhancement of innate immune responses of pigs. 相似文献
14.
Kokuho T Inumaru S Watanabe S Kubota T 《Veterinary immunology and immunopathology》2003,91(2):155-160
Porcine IL-12Rbeta2 gene was cloned from mRNA preparation of mitogen-activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and its complete nucleotide sequence was determined. To confirm the biological function, the entire open reading frame (ORF) was re-cloned into a mammalian expression vector, pcDNA3.1/Zeo(+), at the downstream of CMV promoter, and introduced to a Th1-like human lymphoma cell line, Jurkat E6-1. Antibiotic-resistant cells retaining the expression construct were selected then, isolated by the limiting dilution method. An established clone (10B10) constitutively expressed chimeric IL-12Rs composed of intrinsic (human) beta1 and extrinsic (porcine) beta2 subunits, and produced interferon (IFN)-gamma in response to IL-12 of both species with optimal PHA/PMA stimulation. The production of IFN-gamma was observed as early as 42 h after culture and appeared to be dose-dependent within the range between 20 and 2000 pg/ml. Thus, this clone not only reacts with IL-12 of both species but also provides a useful tool for quick and sensitive detection of IL-12 bioactivity. 相似文献
15.
广西沼泽型水牛IL-4和IL-5基因的克隆及其序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
从刀豆素A(Concanavalin A,ConA)刺激的广西沼泽型成年水牛外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cells,PBMCs)中提取总RNA,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增出白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-5(IL-5)基因,分别克隆到pMD18-T载体上,进行序列分析。结果表明,从培养9 h、17 h的单个核细胞中扩增得到的IL-4基因在核苷酸水平上与GenBank上登录的印度水牛IL-4 cDNA序列同源性为98.8%,与牛、绵羊、猪和马的同源性分别为99.3%、94.1%、84.8%和80.6%;氨基酸水平的同源性分别为96.3%、98.5%、90.4%、78.4%和59.6%。从培养12 h的单个核细胞中扩增得到的IL-5基因在核苷酸水平上与GenBank上登录的牛、绵羊、猪和马IL-5 cDNA序列同源性分别是99.0%、96.5%、89.6%和89.1%;氨基酸水平的同源性分别为97.8%、96.2%、85.9%和86.7%。本研究为进一步了解水牛IL-4和IL-5的结构和水牛免疫学特性奠定了基础。 相似文献
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CD28 is one of the most important co-stimulatory molecules required for effective activation of resting T cells in human and mouse. However, there are few studies on porcine CD28 (pCD28) until now. In the present study, we cloned and characterized the full-length cDNA of CD28 from the miniature?pig. The open reading frame (ORF) sequence of pCD28 gene was organized into four exons, which were predicted to be in correspondence with the signal sequence, immunoglobulin variable-like (IgV) domain, transmembrane domain and cytoplasmic tail, respectively. We also identified the putative ligand binding site of CD28 within the IgV domain and the consensus motifs (one "YMNM" motif and two proline-rich motifs) within the cytoplasmic domain. Porcine CD28 was confirmed to be expressed on the cell membrane as indicated by indirect immunofluorescence assay (IFA). The putative promoter region of pCD28 was also cloned by the modified nested PCR and the cloned region could successfully drive the expression of yellow fluorescent protein (YFP) expression in porcine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The present study is the first report of cloning and characterization of CD28 in porcine. Our work provided fundamental information for further researches on the structure and function of CD28 in porcine. 相似文献
18.
为了解猪Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和进化关系,本研究从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体5基因的cDNA序列。序列全长2641bp,其中2571bp的开放阅读框编码856个氨基酸残基的猪TLR5,含17.4%的亮氨酸,并有一段19个氨基酸的信号肽序列;同源性分析结果显示,TLR5在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、山羊、绵羊、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为77.5%、79.6%、78.3%、81.0%、69.2%和68.9%。蛋白分子结构预测结果表明,该分子由胞外区(642个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(191个氨基酸)组成,胞外区具有LRR结构域,胞内区具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征。表明猪TLR5分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。 相似文献