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绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是源于海洋生物多管水母(aequoia victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光，能在活细胞内稳定表达，本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒，并利用胶回收试剂盒纯化质粒，采用氯化钙法将工程菌DH5a制成感受态细胞，然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中，使得工程菌DH5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌，并表达绿色荧光蛋白，接种于加氨苄青霉素的LB培养基上，筛选阳性克隆。 相似文献
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【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus, rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。【结果】PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体... 相似文献
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利用电击转化法将表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的原核表达载体pTurboGFP-B转化到产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）F4ac中，获得表达绿色荧光的菌株ETEC F4ac-GFP。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）结果显示，转化菌株表达绿色荧光蛋白编码基因，且可以在蓝光仪和荧光显微镜下清晰地观察到转化菌株发出绿色荧光；将ETEC F4ac-GFP与IPEC-J2细胞系进行体外粘附试验，在细胞水平验证了转化菌株荧光表达的稳定性与可靠性，且ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的胞粘附能力。CCK-8(Cell Counting Kit-8)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明，ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的毒力。本研究为深入探究ETEC F4ac致病机理提供了工具菌株。 相似文献
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从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
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从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
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为了构建叉头框L2(Forkhead box L2,FOXL2)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因复制缺陷型腺病毒载体,试验将克隆的FOXL2基因与IRES-GFP片段通过酶切、纯化等方法共同连接到pShuttle-CMV载体中,再与pAdEasy-1腺病毒质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到复制缺陷型AD-FOXL2腺病毒载体,再用PacⅠ酶线性化后转染HEK293细胞,观察绿色荧光表达,并测量病毒效价。结果表明:将AD-FOXL2腺病毒载体用PacⅠ酶线性化后,得到1个大于23 kb的大片段和1个4.5 kb的特异性小片段,证明同源重组成功;将所得的腺病毒载体转染HEK293细胞,可以观察到GFP的表达,证明包装成功,并测得病毒效价为1×10-8.61/0.1 mLTCID50。 相似文献
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将传染性支气管炎病毒（IBV）ZJ971 S1基因亚克隆到绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP—C2中，成功构建重组表达质粒pEGFP—ZJ971-S1。重组质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞，借助荧光显微镜在转染后4h观察到S1—GFP融合蛋白的瞬时表达。免疫细胞化学染色（ICC）结果显示，抗ZJ971 S1D蛋白单克隆抗体和鸡抗IBVZJ971全病毒血清特异性识别了S1基因转染细胞，表明S1蛋白在Vero细胞中得到有效表达。荧光显微镜观察和ICC均表明，S1表达蛋白主要分布在转染细胞的胞浆内，而胞核中未见分布，提示IBVS1蛋白内可能存在与病毒装配相关的细胞定位信号。 相似文献
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鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。 相似文献
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【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶(LUC)、EGFP和Ampr报告基因,构建9种乳酸菌表达质粒,电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞,筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平,利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量,并检测表达蛋白的活性,以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示,在9株重组乳酸菌中,分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间... 相似文献
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自发病眼镜蛇体内分离的细菌经形态学观察、培养特性及生化试验,鉴定为大肠杆菌。该大肠杆菌做动物试验,可致小白鼠死亡,说明其具有一定的毒力。用临床上常用的14种抗菌素纸片对分离菌株进行药敏试验,筛选出敏感药物用于临床治疗取得良好效果,有效控制了眼镜蛇大肠杆菌病的流行。 相似文献
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研究长治鸡群大肠杆菌耐药状况、交叉耐药状况、多重耐药状况及是否出现超级大肠杆菌,同时为临床用药提供参考,减少用药成本,控制大肠杆菌的危害,增加养殖户的收入.剖解病死鸡,采集可疑病料进行细菌分离培养鉴定,通过药敏试验确定其耐药情况.试验结果:长治鸡群大肠杆菌对氨苄青霉素耐药程度83%;对红霉素耐药程度67%;对复方新诺明耐药程度50%;先锋V耐药程度50%;对诺氟沙星耐药程度50%;对万古霉素耐药程度50%;对氯霉素耐药程度33%;对庆大霉素耐药程度33%;对阿米卡星耐药程度17%;对环丙沙星耐药程度17%;对利福平耐药程度17%;对复达欣耐药程度17%;对新生霉素耐药程度为0.结论:长治鸡群分离出的6株大肠杆菌中的5株为多重耐药性大肠杆菌,目前未出现超级大肠杆菌.对常用抗菌药物中的青霉素类、大环内酯类、头孢类、喹诺酮类耐药程度达到50%以上,分别为83%、67%、50%、50%;对新药万古霉素的耐药程度也达到了50%. 相似文献
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Prevalence of Escherichia coli O157 in cattle at the farm level is mostly determined by taking individually rectal samples. From the animal welfare point of view the collection of such samples on the farm is not advisable. The present study evaluated alternative sample types to assess the E. coli O157 status of cattle farms. Twelve closed cattle farms were visited twice with a time interval of 6-8 months. Rectal and hide surface samples (the nose, the neck, the shoulder, the flank, and the round) were collected from beef cattle within the period of 5 months before slaughter and from their environment (overshoes from the pen bedding, swabs from the pen barrier, feed and water). Statistical analysis revealed that from all samples taken only the "overshoe method" might be a good sampling technique to substitute the collection of individual fecal samples to establish the E. coli O157 status of a farm and even a pen. Characterization of the isolates, using pulsed field gel electrophoresis, revealed that on each positive farm only one genotype was presented, even after a period of more than 6 months. 相似文献
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用茜草秧、苦参、公英等13味中药组方,对鹅大肠杆菌耐药菌株和非耐药菌株进行体外抑菌及临床治疗试验。结果,中药组方对两菌株都有较好的体外抑菌效果;临床治疗有效率100%,治愈率达90%以上。 相似文献
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采取质粒shuffling方法,将含GFPmut1的pPS858和能在布鲁菌中复制的质粒pBBRlMCS-2经KpnI酶切后连接,转化DH5a,利用双抗性筛选重组质粒pBBR1-GFP。将荧光质粒转入布鲁菌,获得荧光标记布鲁菌,并用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞J774A．1,探讨其用于细胞侵袭试验的可行性。结果显示,成功构建布鲁菌荧光报告质粒pBBR1-GFP,用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞后,在细胞内观察到带荧光的布鲁菌,且荧光强度与胞内细菌数成正比。细胞侵袭动态试验结果表明,细菌与细胞共孵育45min后,胞内细菌达到饱和。结果表明,成功构建了布鲁菌的荧光质粒报告系统,可用于布鲁菌细胞侵袭试验。 相似文献
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Loneragan GH Brashears MM 《Journal of the American Veterinary Medical Association》2005,226(8):1378-1383
OBJECTIVE: To evaluate the effects of using retention-pond water for dust abatement on performance of feedlot steers and carriage of Escherichia coli O157 and Salmonella spp. DESIGN: Matched cohort studies. ANIMALS: 2 groups of feedlot steers comprising 3,510 (pathogen carriage) and 3,737 (performance) animals housed in a large commercial feedlot in the Texas Panhandle. PROCEDURE: Steers were systematically allocated to treatment pens approximately 60 days after arrival (pathogen carriage) or at arrival (performance). For evaluation of pathogen carriage, feces and hide swab specimens were collected from 25 animals in each pen within 10 days of slaughter. Samples were submitted for bacterial culture for E. coli O157 and were tested with a polymerase chain reaction-based assay for Salmonella spp. For evaluation of performance, pen weights of animals were obtained at arrival and slaughter and feed delivered to each pen was recorded. The exposure of interest for both studies was application of retention-pond water through fixed high-pressure sprinklers. RESULTS: Carriage of E. coli O157 and Salmonella spp and animal performance were not adversely affected by exposure to retention-pond water. Prevalences of E. coli O157 in feces, on hides, and either in feces or on hides for those exposed to retention-pond water were 8.3%, 8.9%, and 15.4%, respectively; prevalences for those unexposed to retention-pond water were 11.4%, 15.4%, and 22.6%, respectively. CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: Results suggest that use of retention-pond water for dust abatement in feedlot pens does not adversely affect pathogen carriage or animal performance. 相似文献
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营养基因组学是研究日粮或营养物质在基因学范畴中,在某个特定时刻,对细胞、组织或生物体的转录组、蛋白质组和代谢组产生影响的一门学科。从20世纪80年代开始,人们逐渐意识到营养素也是一种基因表达的调控物质,可直接或独立地调控基因表达。随着人类基因组计划的完成及正在开展的家畜基因组测序工作的顺利进行,营养科学已经从机体代谢和组织细胞的层面发展到基因层面上来;且从研究营养素对单个基因的表达及作用开始向基因组及表达产物在代谢调节中的作用,即营养基因组研究方向发展。本文将就营养基因组学的概念、所涉及到的主要技术、主要研究进展及其在动物生产领域的应用前景做一综述。 相似文献
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根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础. 相似文献
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敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。 相似文献