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1.
《中国兽医学报》2020,(9)
trpE基因在鼠伤寒沙门菌中编码邻氨基苯甲酸合酶Ⅰ并参与氨基酸生物合成和代谢。为鉴定鼠伤寒沙门菌Hfq依赖型小RNA GcvB所调控的基因trpE,本研究基于前期鼠伤寒沙门菌Hfq基因敲除株及gcvB基因敲除株转录组分析基础上,利用Red同源重组系统构建trpE基因lac融合菌株,并利用P22噬菌体转导技术构建gcvB和Hfq基因单缺失和双缺失菌株,通过β半乳糖苷酶试验检测trpE基因在不同情况下蛋白表达活性,结合生物信息学系统TargetRNA2预测GcvB R1区与trpE mRNA的作用位点。结果表明,与野生型菌株相比,gcvB基因敲除导致trpE基因蛋白表达量增加1.2倍,Hfq基因敲除后表达量增加1.1倍,而双敲除增加量仅为0.5倍。Target RNA2预测trpE mRNA与GcvB R1区可形成8个连续或18个不连续的碱基互补。以上结果表明trpE基因受GcvB和Hfq调控,且极大可能受GcvB直接调控。本研究为鼠伤寒沙门菌GcvB的作用机理研究奠定理论基础,丰富了GcvB的靶基因数目。 相似文献
2.
为筛选鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB调控的靶基因,本研究通过TargetRNA2软件预测能与GcvB R1、R2和R3区产生作用的基因,将鼠伤寒沙门菌gcvB基因敲除株的转录组测序结果注释到KEGG数据库以及GO富集分析,并利用荧光定量PCR对预测的靶基因进行验证。TargetRNA2的预测结果显示,杂交能量最高的narY、yeaK、trpB和STM2732基因均能够和小RNA GcvB产生至少7个连续的碱基互补,narY、yeaK和trpB基因分别与鼠伤寒沙门菌无氧呼吸、脯氨酸与tRNA的识别以及色氨酸的合成相关。荧光定量PCR检测结果显示,narY、yeaK、trpB和STM2732基因在gcvB基因敲除条件下转录水平分别上调3.4、9.8、12.1和18.37倍。以上结果表明,narY、yeaK、trpB和STM2732基因受小RNA GcvB的负调控且可能为直接负调控。本研究为进一步探明小RNA GcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制以及沙门菌致病机制奠定了基础。 相似文献
3.
《畜牧兽医学报》2020,(4)
为筛选鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB调控的靶基因,本研究通过TargetRNA2软件预测能与GcvB R1、R2和R3区产生作用的基因,将鼠伤寒沙门菌gcvB基因敲除株的转录组测序结果注释到KEGG数据库以及GO富集分析,并利用荧光定量PCR对预测的靶基因进行验证。TargetRNA2的预测结果显示,杂交能量最高的narY、yeaK、trpB和STM2732基因均能够和小RNA GcvB产生至少7个连续的碱基互补,narY、yeaK和trpB基因分别与鼠伤寒沙门菌无氧呼吸、脯氨酸与tRNA的识别以及色氨酸的合成相关。荧光定量PCR检测结果显示,narY、yeaK、trpB和STM2732基因在gcvB基因敲除条件下转录水平分别上调3.4、9.8、12.1和18.37倍。以上结果表明,narY、yeaK、trpB和STM2732基因受小RNA GcvB的负调控且可能为直接负调控。本研究为进一步探明小RNA GcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制以及沙门菌致病机制奠定了基础。 相似文献
4.
为筛选与沙门菌小RNA gcvB相关的靶基因,采用高通量的转录组测序(RNA-seq)技术对野生型沙门菌和敲除小RNA gcvB沙门菌的mRNA进行对比分析,全面地预测GcvB的靶基因的数量与种类,通过GO和KEGG数据库对筛选基因进行比对注释,进一步分析筛选基因的主要功能及涉及的生物过程。并利用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示:差异表达基因共1 244个,其中基因表达上调678个,基因表达下调566个。GO富集分析显示,差异表达基因主要涉及氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等分子功能,细菌鞭毛的细胞成分,细胞呼吸、钴胺素代谢过程和钴胺素生物合成过程等生物过程。KEGG数据库分析显示,差异表达基因主要参与细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路。对筛选出的10个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:差异表达基因相对表达量与RNA-seq测序结果基本一致。本研究为进一步探明小RNA gcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制,以及沙门菌致病机制奠定了基础。 相似文献
5.
《畜牧兽医学报》2019,(12)
旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路,筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证,从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路进行深入分析,筛选相关的重要调控基因。结果显示:在细菌趋化性通路中筛选出yiaD、STM3138、STM3216和malE等4个共表达基因;在细菌分泌通路中筛选出spaP、invA、prgH、invE、spaS、invG和ssaV等7个共表达基因;在细菌双组分通路中筛选出ybfM、htrA、pagO、STM3138、STM3031、ttrB、hilD、pstS、STM1530、hilA、pgtC、hydH、pocR、STM3216、ttrR和fljB等16个共表达基因。在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路中筛选出差异表达基因,hfq能够对这些基因进行调控,从而影响如运动性、毒力等相关作用,为沙门菌中的sRNA与hfq后续研究及沙门菌的防治奠定一定基础。 相似文献
6.
旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。 相似文献
7.
鼠伤寒沙门菌cpxR和acrB双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《畜牧兽医学报》2016,(3)
为了探索cpxR基因对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制,同时避免外排泵acrB的存在掩盖cpxR对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用,利用基于Red同源重组系统的一步法失活染色体基因,用含有同源臂的线性打靶DNA片段替换目的基因,构建鼠伤寒沙门菌JS株的acrB基因缺失株JSΔacrB。然后利用噬菌体转导技术,以前期构建的cpxR缺失株JSΔcpxR∷kan为供体菌,本研究新构建的JSΔacrB为受体菌,在P22噬菌体的作用下构建双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan,同时制备cpxR基因回补菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。最后用微量稀释法测定10种临床常用代表性抗菌药物对JS和各缺失株的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,成功构建鼠伤寒沙门菌的双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan以及其cpxR基因互补菌株JSΔacrBΔcpxR/pcpxR。MIC结果显示,acrB基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松和头孢噻呋的MIC值分别降低32、4、4、16、32、4、2和128倍;双基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的MIC值进一步降低2、8、2和2倍;而将cpxR基因回补之后,这4种抗菌药物的MIC值会升高4、16、2和4倍。结果表明,cpxR能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性。 相似文献
8.
为揭示鼠伤寒沙门菌SL-1344菌株RcsCDB系统STM1863调控子分子特征,及对STM生物学特性的影响。本研究通过PCR扩增STM1863基因并进行克隆和测序,预测分析其编码蛋白的分子特征;利用λ-Red同源重组技术构建STM-ΔSTM1863基因缺失突变株,并对其生化特性、遗传稳定性、酸碱胁迫环境中的适应性及粘附侵袭小鼠巨噬细胞的能力进行研究。结果显示：STM1863基因全长159 bp,编码52个氨基酸,具有一个跨膜和d1p32a同系物结构域;与SL-1344亲本株相比,STM-ΔSTM1863缺失株生化特性与亲本株无明显差异,生长速度与亲本株生长速度一致,但STM-ΔSTM1863在p H4.0酸应激下对数期生长速度显著低于亲本株（P<0.05）;粘附和侵袭小鼠巨噬细胞能力与亲本株相比极显著降低（P<0.01）。提示STM1863因参与了STM酸应激和粘附侵袭宿主细胞的调控,本研究为深入揭示STM1863对STM粘附侵袭宿主细胞的调控机制提供了参考。 相似文献
9.
利用λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株,并检测其生长特性、运动性、生物被膜形成能力、胞内存活能力及LD50毒力。结果显示,与野生型菌株相比,oppCDF基因缺失株的生长特性无明显变化;oppCDF基因缺失株可降低鼠伤寒沙门菌的运动性;oppC与oppF基因缺失后可提高鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力;同时,oppC基因缺失可降低在RAW267.4细胞内的存活能力和其在小鼠体内的毒力,oppF基因缺失可显著增强在RAW267.4内的存活能力和对小鼠毒力的影响,而oppD基因缺失后其在小鼠体内的毒力和RAW267.4内的存活率均无显著变化。研究表明,oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌的运动性、生物被膜形成和毒力密切相关,为进一步揭示鼠伤寒沙门菌致病作用中的复杂调控和机制提供了理论基础。 相似文献
10.
为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。 相似文献
11.
《中国预防兽医学报》2016,(1)
为验证一种基于定点突变的无痕基因敲除技术(Scarless deletion)在鼠伤寒沙门菌中的有效性,本研究以鼠伤寒沙门菌中的lux S基因为靶基因,利用-Red重组酶和重叠延伸PCR(SOE-PCR)引入定点突变,以AAA代替lux S基因的起始密码ATG,改变lux S基因编码序列,通过测序验证并采用2型自诱导物(AI-2)试验检测是否有信号分子产生。基因测序结果显示lux S基因的起始密码ATG被引入的AAA代替;AI-2试验未检测到突变基因菌株的AI-2产物,而对照的野生菌株有AI-2产生,表明突变基因失活,方法有效。利用无痕基因敲除技术构建突变株简单快速,并且不影响被突变基因的另一条DNA单链序列,具有广泛的应用前景。 相似文献
12.
《中国畜牧兽医》2019,(11)
本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd~+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493)构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430(pYA-gfp),对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493),能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
13.
本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
14.
15.
《畜牧兽医学报》2019,(11)
本研究旨在探索baeSR和acrB基因缺失后对鼠伤寒沙门菌相关毒力基因表达的影响。采用RNA-Seq技术筛选鼠伤寒沙门菌体外诱导环丙沙星耐药株(CR)、acrB基因缺失株(CRΔacrB)、baeSR和acrB基因双缺失株(CRΔbaeSRΔacrB)的差异表达基因,对筛选的基因进行GO富集和KEGG通路富集分析,进一步探究差异表达基因的主要功能及涉及的生物过程,并选出7个差异显著基因进行荧光定量PCR验证。结果表明CRΔacrB与CR相比较,共筛选到1 320个差异表达基因(fold change的绝对值2,Q-value0.005),其中上调426个,下调894个;CRΔbaeSRΔacrB与CR相比较,共筛选到1 377个差异表达基因(fold change的绝对值≥2,Q-value0.005),其中上调405个,下调972个,两个比较组筛选到的毒力相关基因均主要富集在双组分系统、鞭毛组件、沙门菌感染和上皮细胞的细菌入侵等通路中。荧光定量PCR验证结果与RNA-Seq结果基本一致。本研究对baeSR和acrB基因在鼠伤寒沙门菌毒力中的作用进行了初步分析和探索,为进一步研究鼠伤寒沙门菌致病机制奠定基础。 相似文献
16.
《中国兽医学报》2019,(6)
为研究锌调控蛋白ZinT在肠炎沙门菌致病中的作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)ZinT基因缺失突变株(C50336ΔZinT),并对其生物学特性进行分析。结果显示,与野生型菌株和回复菌株相比,缺失株C50336ΔZinT在LB培养基中生长速度无明显差异,生化特性亦无明显变化,但其在Minimal培养基中生长明显变慢。此外缺失株C50336ΔZinT对H_2O_2处理和高渗环境的适应能力显著下降,但在巨噬细胞内的存活率无明显降低。动物试验表明,ZinT基因缺失突变株的毒力和野生型菌株相比仅有轻微下降。本试验探讨了ZinT与肠炎沙门菌锌摄取和毒力间的联系,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2020,(7)
为筛选鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq所调控的基因,本实验基于本研究室前期对指数生长期和稳定期的鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果,从中随机挑选6个在转录水平差异表达的基因,并通过荧光定量PCR技术验证转录组数据的可靠性,然后在转录组数据可靠的前提下将两个转录组中所有显著差异表达(log_2FoldChang1)的基因GO富集细菌致病机制生物学过程,Pathway富集细菌ABC转运通路和群体感应通路,在富集得到的基因中筛选指数生长期和稳定期均表现为转录水平差异表达且趋势相同的基因。荧光定量PCR检测结果显示,6个基因转录水平差异上调或下调的趋势与转录组分析结果中一致,表明转录组数据可靠,可进行后续的研究。GO与Pathway富集结果显示,在鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株指数期和稳定期中均表现为转录水平差异上调或下调且差异倍数均大于2的基因共26个。其中,与细菌致病机制生物学过程相关的13个基因均上调;与细菌ABC转运通路相关的基因11个,其中9个基因转录水平均上调2个基因转录水平均下调;与细菌群体感应相关的2个基因转录水平均上调。26个基因中仅rpoE经验证受Hfq直接调控。以上结果表明,Hfq主要参与细菌致病机制生物学过程以及细菌ABC转运通路的负调控。本研究为后续Hfq靶基因的鉴定及其作用机理的研究提供了理论基础,同时丰富了Hfq调控基因的数目。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2015,(10)
为研究鼠伤寒沙门菌双组分信号系统的应答调节蛋白基因cpxR对菌株药物敏感性的影响,本研究以p KD4质粒为模板,利用PCR扩增两侧与cpxR基因上下游同源且含有卡那霉素抗性(kanr)基因的线性打靶DNA片段,在p KD46质粒的辅助下进行Red同源重组,利用线性打靶DNA片段替换鼠伤寒沙门菌CVCC541(JS)株的cpxR基因,再利用p CP20质粒消除FRT位点间的kanr基因,构建基因缺失株JS△cpxR。并将重组表达质粒p BAD-cpxR转化于JS△cpxR中,制备回补菌株JS△cpxR/pcpxR。利用微量稀释法测定12种代表性抗菌药物对亲本株JS、JS△cpxR和回补菌株JS△cpxR/pcpxR的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、头孢噻呋(CEF)和头孢曲松(CRO)对亲本株JS的MIC值分别为JS△cpxR的4、4、4和2倍;而随诱导剂L-阿拉伯糖浓度的增高,这4种药物对回补菌株JS△cpxR/pcpxR的MIC值均逐渐恢复到亲本株JS的水平,呈剂量依赖性关系,而且高浓度诱导时4种药物对回补菌株的MIC分别为JS△cpxR的16、8、8和16倍,其他药物的MIC值未出现明显的变化。本研究结果表明:cpxR能够调控鼠伤寒沙门菌对GEN、AMK、CEF和CRO的敏感性。 相似文献
19.
基于转录组测序筛选鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失菌的差异表达基因 总被引：2，自引：2，他引：0
旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路，筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证，从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路进行深入分析，筛选相关的重要调控基因。结果显示：在细菌趋化性通路中筛选出yiaD、STM3138、STM3216和malE等4个共表达基因；在细菌分泌通路中筛选出spaP、invA、prgH、invE、spaS、invG和ssaV等7个共表达基因；在细菌双组分通路中筛选出ybfM、htrA、pagO、STM3138、STM3031、ttrB、hilD、pstS、STM1530、hilA、pgtC、hydH、pocR、STM3216、ttrR和fljB等16个共表达基因。在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路中筛选出差异表达基因，hfq能够对这些基因进行调控，从而影响如运动性、毒力等相关作用，为沙门菌中的sRNA与hfq后续研究及沙门菌的防治奠定一定基础。 相似文献
20.
为了研究载体菌株Δasd LH430 (pYA3493)携带外源基因的能力,试验采用分子生物学方法构建了携带铜绿假单胞菌的保护性抗原基因F_(190-342)-I_(21-83)(F1I2)的重组表达质粒pYA-F1I2,将其重组到减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌Δasd LH430 (pYA3493)中,成功构建重组菌株Δasd LH430 (p YAF1I2),并研究了重组菌株的遗传稳定性、表型、毒力。结果表明:构建的重组菌株Δasd LH430 (pYAF1I2)能够稳定遗传所携带的F190-342和I21-83基因;重组菌株生长速度略低于亲本菌株,且遗传了亲本菌株的糖利用能力,在碳源利用方面没有改变;与亲本菌株相比,重组菌株毒力略有下降,对动物更加安全。说明重组菌株Δasd LH430 (pYA-F1I2)可作为铜绿假单胞菌-沙门氏杆菌二联疫苗的候选菌株。 相似文献