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1.
【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。 相似文献
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【目的】研究棉花GhPAO3基因的功能,通过CRISPR/Cas9技术构建棉花GhPAO3基因的基因编辑载体。【方法】筛选合适的两个PAM位点设计引物,在引物中添加接头,重叠延伸PCR,将两个靶标片段连接在一起。通过限制性核酸内切酶BsaⅠ对pRGEB32-7载体进行单酶切,使用一步法连接重叠延伸产物与线性化的pRGEB32-7载体。【结果】使用电击转化法将构建好的棉花GhPAO3基因的基因编辑载体转入农杆菌LBA4404感受态,通过卡那霉素筛选阳性单克隆菌株。【结论】条带大小与预期一致,棉花GhPAO3基因的基因编辑载体构建成功。 相似文献
3.
【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g -1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g -1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。 相似文献
4.
近年来,规律间隔成簇短回文系统（CRISPR-Cas）作为基因编辑手段在动植物基因编辑中已广泛应用。现已被证实的Class2类CRISPR-Cas系统CRISPR-Cas12、CRISPR-Cas14等均通过生物信息学手段被发掘出来,因此,生物信息学成为发现新CRISPR-Cas系统及其子类型的重要方法。笔者综述了Cas酶两类生物信息学发掘手段,一类方法是通过已知Cas酶建立隐马尔科夫模型（HMM）预测可能的同类Cas酶;另一类方法是以标志序列Cas1或CRISPR识别为基础分析上下游可能的Cas酶,同时讨论了两种方法的限制。在此基础上,综述了Cas蛋白和CRISPR序列进一步分析方法,包括Cas蛋白同源性、进化分析及CRISPR序列间隔序列（spacers）、前间隔序列（protospacers）前间隔序列临近基序（PAM）分析。 相似文献
5.
【目的】 回顾近年来基因编辑技术在园艺作物中的研究进展,为园艺作物的基础研究与品种培育提供参考。【方法】 从国内外文献资料中收集查阅CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中的研究报道,对其分析汇总。【结果】 传统育种手段难以满足园艺作物对产量和品质日益增长的需求,CRISPR/Cas9技术为其品种改良开辟新的道路,改变园艺作物育种格局,促进其在抵御生物胁迫,响应非生物胁迫,提高果实品质和作物驯化。【结论】 CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中是育种工作不可或缺的关键性技术。 相似文献
6.
【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。 相似文献
7.
【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11（ZH11）的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T2代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T2后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。 相似文献
8.
【目的】生长素输出载体蛋白（PIN-FORMED,PIN）是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据。【方法】根据OsPIN9序列设计特异性编辑位点,构建OsPIN9编辑载体,以日本晴愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法获得抗性植株,通过PCR鉴定转基因植株。转基因植株通过PCR和测序明确OsPIN9的突变类型,获得ospin9纯合突变体并分析突变蛋白与野生型蛋白的差异。qRT-PCR分析突变体幼苗根部OsPINs的表达,进一步明确突变体与野生型对照植株之间的表型差异。以0.05 μmol·L-1的萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid,NAA）处理幼苗7 d,分析NAA对植株表型的影响。【结果】在水稻OsPIN9第1外显子处设计靶点并构建表达载体,通过遗传转化成功获得18株T0代转基因植株,测序分析发现转基因株系中有3种不同的突变方式,均为在靶位点的18位碱基处插入不同的单碱基,其中,3株插入T碱基,3株插入G碱基,1株插入C碱基,共获得基因编辑株系7株,进一步鉴定获得2种纯合突变体。序列比对分析表明,这两种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的426个氨基酸缩短为172个氨基酸,跨膜螺旋结构域分析表明突变体中OsPIN9蛋白的跨膜结构完全消失。qRT-PCR分析表明,2个突变株系的OsPIN9转录水平显著降低,OsPIN1a和OsPIN5b表达上调,而OsPIN5a表达受到抑制。幼苗期的表型分析表明,突变体的株高显著低于野生型,不定根数显著少于野生型,但根长没有显著变化。NAA处理下,植株的生长受到抑制,ospin9突变体的不定根数仍少于野生型,但差异已不显著。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻生长素输出载体蛋白OsPIN9进行定向编辑,可获得无转基因成分的基因编辑植株,OsPIN9的突变影响其他OsPINs的表达,ospin9突变体的地上部和地下部的发育都受到抑制,NAA处理能部分恢复突变体不定根的发育。 相似文献
9.
基因编辑是一项对目的基因进行修饰的新技术,由成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR associated,Cas)组成的系统(CRISPR/Cas)为新一代基因编辑技术,其中Cas9蛋白与CRSPR结合形成的编辑系统CRISPR/Cas9因其简单易操作的特性已广泛应用于植物基因组编辑,发展潜力巨大.文章论述了CRISPR/Cas9系统的作用原理、发展历程及在植物基因组中的定点编辑效应,并分析CRISPR/Cas9在水稻、小麦、玉米等作物育种中的应用现状,发现其在改良水稻产量和质量相关性状、小麦白粉病抗性及玉米乙烯敏感等性状上效果明显.在今后的研究中,应针对不同作物的育种目标,深入了解目标基因的功能作用来设计相应的操作方案,并提高该系统对作物目的基因改良的效率,加强其安全性等,以促进基因编辑在作物育种中的应用,加快育种进程. 相似文献
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[目的]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因(OsC3H54)进行基因编辑,筛选鉴定出其突变体植株,为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料,也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据.[方法]通过E-CRISP在OsC3H54基因的外显子上设计靶点序列,将靶点序列连接至OsU6SK载体上,再与Cas9一起连接到pCAM-BIA1300双元载体上,获得CRISPR/Cas9重组双元载体,通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织,利用潮霉素进行抗性筛选,获得突变体植株,并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况.[结果]在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点,分别为TG1:5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2:5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'.将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重组载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2).通过农杆菌介导转入日本晴水稻,经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系,共16株CRISPR/Cas9突变体植株.CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰,表明2个株系的植株均发生碱基突变,其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变,最终导致编码的氨基酸发生移码突变,蛋白翻译提前终止.[结论]水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料. 相似文献
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【目的】构建甜瓜eIF4E基因的CRISPR-Cas9植物基因编辑系统的gRNA 表达载体。为研究eIF4E基因功能奠定基础。【方法】以新疆主栽甜瓜皇后为材料,在eIF4E基因的第一个外显子区设计gRNA引物,以载体pP1C.4为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.4载体,利用DNA重组酶构建重组载体pP1C.4-eIF4E。【结果】经菌落PCR检测和测序,gRNA 已经成功连接到植物基因敲除载体pP1C.4。【结论】构建了植物基因敲除载体pP1C.4-eIF4E,pP1C.4-eIF4E能对eIF4E基因进行定向编辑。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9技术研究玉米ZmFKF1在开花过程中的作用 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】FKF1是多种植物开花途径中发挥重要作用的关键基因。为研究玉米FKF1功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ZmFKF1进行定点编辑,获得ZmFKF1编辑突变体。同时以此为材料,通过表型分析及关键开花基因的表达量变化分析,明确ZmFKF1在玉米开花途径中的作用,为玉米分子育种及遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米B104为材料,克隆ZmFKF1,通过序列比对明确ZmFKF1的基因结构。以ZmFKF1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶点,将设计的靶点序列在玉米参考基因组中进行比对分析,排除非特异性靶位点,最终筛选出在ZmFKF1第1外显子上的靶位点ZmFKF1-T1,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体。利用农杆菌介导法,转化玉米B104幼胚,通过抗性筛选获得抗性愈伤组织,之后诱导出芽和生根,获得T0代ZmFKF1编辑阳性植株,并利用cas9特异引物进行验证。利用靶位点扩增测序法,明确T1代ZmFKF1编辑植株在ZmFKF1预期靶标位点是否发生突变及突变的类型,筛选获得ZmFKF1定点突变纯合株系。获得这些材料后,以野生型B104为对照,统计和分析开花表型。同时,利用实时荧光定量PCR技术检测上述材料中与玉米开花途径相关的关键基因的表达量变化,对表型进行进一步的验证。【结果】在玉米FKF1的第1外显子上设计靶点构建基因编辑表达载体,通过遗传转化获得的转基因株系实现了对ZmFKF1的定点突变,共获得T0代ZmFKF1编辑阳性株系18株,在预期靶标位点上发生突变的有6株,2种不同的突变类型：单碱基插入和多碱基缺失。通过开花时间统计和分析,与野生型B104相较,3个T2代ZmFKF1编辑纯合突变体的开花时间延迟,显著（P＜0.05）晚于B104。进一步对这些材料中的开花关键基因ZmGI、conz1和ZmZCN8进行表达量检测,发现突变体中这些基因的表达明显（P＜0.05）低于野生型B104,与晚花表型相符。【结论】可利用CRISPR-Cas9技术对ZmFKF1进行定点编辑获得基因编辑突变体,且突变体开花时间明显延迟。 相似文献
13.
【目的】 利用DNA条形码技术与形态学相结合鉴定中国新纪录种艾弗斯曼多眼蝶Kirinia eversmanni,为其准确鉴定,以及开展该蝴蝶生物学、生态学研究提供参考。【方法】 以艾弗斯曼多眼蝶成虫腹部为材料提取基因组DNA,线粒体细胞色素氧化酶I(Cytochrome Oxidase I,COI)基因作为通用引物进行PCR扩增,将其序列作为艾弗斯曼多眼蝶的DNA条形码,并解剖艾弗斯曼多眼蝶的雄性外生殖器,描述其雄性外生殖器的形态结构结合其翅面特征。【结果】 艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列长度为696 bp,与NCBI中已知序列相似性最高可达99.70%,研究物种与NCBI中已有纪录种Kiriniaeversmanni为同一物种。对艾弗斯曼多眼蝶翅面特征以及雄性外生殖器的阳茎、背兜及抱器瓣等结构进行描述形态学特征与获得的序列相结合可作为艾弗斯曼多眼蝶的多个鉴别特征。【结论】 利用DNA条形码序列结合形态学描述使得对艾弗斯曼多眼蝶的鉴定结果更加全面准确。 相似文献
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【目的】 研究更加便捷高效的鉴定技术,提高叶蝉鉴定的速率,为帕米尔高原南麓部分地区叶蝉的鉴定及防治提供基础数据。【方法】 利用DNA条形码技术,选择mtDNA COI、Cytb、ITS2基因,运用通用引物PCR扩增并直接测序,借助生物信息学分析软件对比分析目的基因序列的相似性,构建系统进化树,分析遗传进化关系,获取叶蝉DNA条形码。【结果】 获得了19条mtDNACO1、Cytb及ITS2基因序列,COI基因6条、Cytb基因7条、ITS2基因6条,可作为叶蝉的DNA条形码,包括其中1条COI新序列,5条Cytb和6条ITS2序列。【结论】 获得19条叶蝉的DNA条形码,实现了帕米尔高原南麓部分地区农田4种叶蝉的快速准确鉴定。 相似文献
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【目的】研究棉蚜茧蜂对不同品种、不同生育期棉花的趋性行为反应,为了解天敌昆虫与寄主之间关系,利用棉蚜茧蜂对棉蚜等害虫进行防控。【方法】以生产上大面积种植的GK-12(对照为泗棉3号)、新棉33B(亲本为新棉33)和SGK321(亲本为石远321)等3组棉花品种为材料,于棉花7叶期、现蕾前期和现蕾期,设计无虫棉植株、被棉蚜为害后剔除虫体的植株以及棉蚜+有虫株等3种不同处理,借助“Y”型嗅觉仪,检测棉蚜茧蜂在棉花不同生育期对这3种不同处理的趋性。【结果】棉蚜茧蜂无法识别健康的常规棉和转基因棉花植株;对不含棉蚜的被害棉来说,转基因棉对棉蚜茧蜂更具吸引力。而对含有棉蚜的有害棉来说,除7叶期GK12、新棉33B和现蕾期GK12这3组处理外,其他各组的转基因棉对棉蚜茧蜂均具较强的吸引作用。【结论】两类不同的棉花品种对棉蚜茧蜂不存在排斥性,棉蚜为害转基因棉花后更能吸引棉蚜茧蜂。 相似文献
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【目的】研究Δ9去饱和酶基因特性及其在不同虫态下的表达,研究EpFAD9基因功能及潜在应用提供数据,为该香梨优玫玉暝、饱和脂肪酸积累中的作用提供参考。【方法】采用生物信息学软件鉴定、分析和预测Δ9去饱和酶(EpFAD9)的核苷酸和氨基酸序列,研究蛋白质结构和功能,并利用qRT-PCR方法测定△9去饱和酶基因在不同虫态下的表达水平。【结果】EpFAD9基因开放阅读框由1 056 bp组成,含352个氨基酸,起始密码子ATG位于获得序列的第1 280碱基上,终止密码子TAA位于该序列第2 338碱基。推测该蛋白无信号肽,共4个跨膜结构域,整体表现为亲水性蛋白,主要在内质网中发挥生物学作用。EpFAD9基因在幼虫期表达量较高,分别是成虫期和蛹期的17.75和29.58倍。【结论】EpFAD9基因基因在香梨优斑螟不同虫态下存在表达差异,在幼虫体内的表达量最高,成虫和蛹期的表达很低,尤其是虫蛹,其表达量更低于成虫,虫蛹和成虫状态下的香梨优斑螟对低温抵抗能力都低于幼虫。 相似文献