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1.
《中国兽医学报》2016,(11):1829-1835
为开发新型重组减毒鸡白痢沙门菌口服活疫苗载体。本研究以pcDNA3.1-Zeo(+)质粒为基础,用沙门菌asd基因替代其氨苄抗性基因Amp,构建不含抗性基因的真核互补质粒pcD-asd;再将互补质粒pcD-asd电转入沙门菌ΔcrpΔasdC79-13,构建ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因EGFP克隆入pcD-asd,构建重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-EGFP),感染鸡胚成纤维(CEF)细胞,Western blot分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株ΔcrpΔasdC79-13及野生株C79-13保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢,对氨苄抗生素敏感;重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)的LD50较野生株C79-13降低了3.4×104倍;Western blot结果发现,重组菌株感染CEF细胞后,可表达大小约为27 000EGFP蛋白。以上结果证实,本研究成功构建了新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)株,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。 相似文献
2.
《畜牧兽医学报》2016,(10)
为研究携带新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因疫苗的重组减毒鸡白痢沙门菌的口服免疫原性,将携带NDV HN基因的重组质粒pcDNA3-HN电转化减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpC79-13,构建重组疫苗菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)。将重组菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)以1×10~9 CFU·只-1口服免疫7日龄雏鸡,同时设PBS、ΔcrpC79-13(pcDNA3)和NDVⅣ系疫苗免疫对照,于免疫后7、14、21、28、35d测定免疫雏鸡诱导的抗NDV的HI抗体、鸡白痢沙门菌IgG抗体和肠道黏膜IgA抗体动态水平,同时测定免疫雏鸡的外周血淋巴细胞增殖水平并进行攻毒试验。结果表明,成功获得携带NDV HN基因疫苗的重组菌株Δcrp C79-13(pcDNA3-HN);在免疫后14~35d,可诱导产生抗NDV的HI抗体,且在免疫后21d时达到最高值;可诱导产生抗鸡白痢沙门菌的IgG抗体,且在免疫后28d达到最高值;Δcrp(C79-13pcDNA3-HN)组肠道黏膜IgA抗体含量最高值略高于Δcrp C79-13(pcDNA3)组,但差异不显著(P0.05)。在免疫28d以后,Δcrp(C79-13pcDNA3-HN)组外周血淋巴细胞刺激指数极显著高于PBS对照组(P0.01),显著高于ΔcrpC79-13(pCDNA3)组(P0.05)。用103EID50 NDV F48E9株攻毒,保护率达67%(10/15),用108 CFU鸡白痢沙门菌C79-13攻毒,保护率为100%。本研究结果表明重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)具有良好的口服免疫原性。 相似文献
3.
为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。 相似文献
4.
试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
5.
为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。 相似文献
6.
《畜牧与兽医》2017,(8):84-87
为了研究携带鸡白痢沙门菌主要外膜蛋白OmpC基因的重组枯草芽孢杆菌活菌制剂在肉鸡上的免疫原性,以具有益生菌属性的枯草芽孢杆菌作为基因疫苗表达宿主,构建表达鸡白痢沙门菌主要外膜蛋白的枯草芽孢杆菌重组菌(pHT43/WB800n-OmpC)。将重组菌饮水饲喂12日龄艾维茵肉鸡,同时设空白、空转菌及非诱导菌对照组,分别于免疫后27和42日龄测定特异性抗体效价,同时45日龄后采用沙门菌C79-13株腹腔注射攻毒。结果:SDS-PAGE分析显示该重组蛋白大小为37 ku;Western blot分析显示表达蛋白具有很好的反应原性;肉鸡饲喂结果显示,42日龄时血清中检测到特异性抗体,且抗体效价为1∶32;攻毒试验显示重组菌诱导组免疫保护率为76.92%,而对照组、空转菌组、非诱导组保护率分别为23.08%、38.46%和30.77%。结果表明:此重组菌对鸡沙门菌具有免疫保护作用,为沙门菌的免疫机制研究奠定了基础,同时实现了饲用疫苗的双重作用。 相似文献
7.
本研究为构建表达产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,从质粒pET-K88ac-STⅡ中扩增编码融合蛋白K88ac-STⅡ的基因并插入线性T载体pBS-T中,经酶切、PCR、测序鉴定正确后,再用限制性内切酶切下,插入含有asd基因的表达载体pYA3334,构建pYA-K88ac-STⅡ重组质粒。重组质粒鉴定正确后电穿孔转入缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸p-半醛脱氢酶基因（Aasd）的鼠伤寒沙门菌（X4550）中,以获得重组菌株X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。结果显示该无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖,口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。通过本试验成功构建了表达K88ac-STⅡ融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。 相似文献
8.
为了研究载体菌株Δasd LH430 (pYA3493)携带外源基因的能力,试验采用分子生物学方法构建了携带铜绿假单胞菌的保护性抗原基因F_(190-342)-I_(21-83)(F1I2)的重组表达质粒pYA-F1I2,将其重组到减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌Δasd LH430 (pYA3493)中,成功构建重组菌株Δasd LH430 (p YAF1I2),并研究了重组菌株的遗传稳定性、表型、毒力。结果表明:构建的重组菌株Δasd LH430 (pYAF1I2)能够稳定遗传所携带的F190-342和I21-83基因;重组菌株生长速度略低于亲本菌株,且遗传了亲本菌株的糖利用能力,在碳源利用方面没有改变;与亲本菌株相比,重组菌株毒力略有下降,对动物更加安全。说明重组菌株Δasd LH430 (pYA-F1I2)可作为铜绿假单胞菌-沙门氏杆菌二联疫苗的候选菌株。 相似文献
9.
为了构建具有asd基因缺失和LacI蛋白表达调控的猪霍乱沙门氏杆菌C500株,试验以猪霍乱沙门氏杆菌C500株为载体,对其基因组进行改造,使沙门氏杆菌asd基因缺失,随后将araC PBADLacI序列置于其中,构建包含araC PBAD-LacI基因表达框的猪霍乱沙门氏杆菌C500Δasd基因突变株以及包含Ptrc启动子的EGFP表达质粒pYA4514-EGFP,并验证是否有LacI蛋白表达。结果表明:试验成功构建出包含araC PBAD-LacI基因表达框的猪霍乱沙门氏杆菌C500Δasd基因突变株,以及包含Ptrc启动子的EGFP表达质粒pYA4514-EGFP; Western-blot检测验证了突变菌在阿拉伯糖存在的条件下可大量表达LacI蛋白,而当pYA4514-EGFP质粒上的Ptrc启动子受到抑制时,EGFP蛋白不表达;用IPTG诱导后可以消除LacI对Ptrc启动子的抑制作用,EGFP蛋白表达。说明试验成功构建了调控表达LacI蛋白的猪霍乱沙门氏杆菌C500Δasd基因突变株。 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2015,(12)
敲除鸡伤寒沙门菌(SG)减毒疫苗株97Aasd基因,构建宿主载体平衡致死系统并表达新城疫病毒(NDV)F蛋白,构建二价活菌苗。PCR扩增两段位于asd基因外侧的序列作为等位基因,以氯霉素抗性(CmR)基因替代asd基因,构建自杀质粒pGMB151Δasd::CmR,通过E.coliχ7213与SG97A固相杂交,将质粒转入SG97A,反向筛选获得SG97AΔasd::CmR,利用质粒pCP20去除CmR后,DAP的依赖菌株命名为SG97AΔasd。将含asd基因的质粒pYA3334转入SG97AΔasd中构建宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白。结果表明,通过等位基因重组方法,成功构建SG97AΔasd及宿主载体平衡致死系统,重组菌能够表达NDV-F蛋白,并能在鸡体内诱导产生特异性抗体。本研究成功构建SG97AΔasd宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白及其诱导宿主产生抗体,为应用该系统构建二价活菌苗的研究奠定了基础。 相似文献
11.
采用抑制性消减杂交技术（SSH）对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析.结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段.经同源分析,这些序列可分为3类：噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列.这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素、IpaJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因.结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门茵Sg9株基因组问存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础. 相似文献
12.
通过PCR克隆出IBDV VP2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-VP2。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（缺失Asd、Cya、Crp基因）,获得重组疫苗菌株X4550（pYA3341-VP2）。进行重组菌VP2蛋白表达的鉴定;测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性以及小鼠免疫试验。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE和Western blot证实重组菌表达的VP2蛋白能与鸡抗IBDV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;口服重组菌免疫小鼠,ELISA检测产生了抗IBDV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。本试验成功构建了能稳定表达IBDV VP2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（pYA3341-VP2）,为研究IBD口服基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
13.
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《中国畜牧兽医》2019,(11)
本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd~+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493)构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430(pYA-gfp),对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493),能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(5)
为研制能够稳定携带外源基因的猪霍乱沙门菌口服活疫苗载体,本研究在减毒猪霍乱沙门菌△cyaC78-1基础上,利用自杀性质粒介导的等位交换技术,构建了△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统,并对其生物学特性进行了鉴定。PCR及测序结果表明△cya△asdC78-1构建正确,其生物学特性检测结果显示△cya△asdC78-1生化特性与△cyaC78-1完全相同,血清型与△cyaC78-1和疫苗株C500相同,并且具有稳定的遗传特性;其生长速度与△cya C78-1基本相同,均明显慢于疫苗株C500。动物试验表明△cya△asdC78-1电转化携带asd基因的互补质粒pYA3493后,其毒力比△crp△asdC78-1(p YA3493)降低1.14倍,比△asdC500(pYA3493)降低了5.1倍。以上结果表明,减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1同样可以作为口服活疫苗载体用于高效表达外源基因,为开发以C78-1为基础的口服多价疫苗载体奠定了基础。 相似文献
16.
本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
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为了开发具有鉴别诊断功能的鸡白痢沙门菌疫苗,通过λ-Red同源重组敲除鸡白痢沙门菌CVCC1800的pagC基因,成功获得ΔpagC菌株;合成细胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPP)制备菌蜕并对处理条件进行了优化。结果显示:作用浓度为50μmol/L,ΔpagC菌液OD_(600 nm)=0.4左右时CPP灭活效果最好。本研究制备的基于ΔpagC鸡白痢沙门菌菌蜕,在保留抗原性的同时为鉴别诊断提供了靶点,为后续开发针对鸡白痢沙门菌的鉴别诊断菌蜕疫苗奠定了基础。 相似文献
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NDV长春株和四平株HN/F核酸疫苗的构建及表达 总被引：5，自引：0，他引：5
将新城疫病毒（NDV）长春株和四平株HN插入pIRES1多克隆位点（EcoRⅤ）中，构建成核酸表达疫苗pIRcHN和pIRsHN，然后切除pIRcHN和pIRsHN的新霉素基因，将长春株和四平株F基因分辊手稿其中，构建成pIRcHNF和pIRsHNF，而后分别转染Hela细胞。经血凝效价测定、Western blot分析，弱毒株构建疫苗的血凝活性比强毒株高1个数量级，Hela细胞表达的HN蛋白量以pIRcHN最高，pIRsHN次之，pIRcHNF和pIRsHNF较低。将重组疫苗转染Hela细胞，用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验，结果，在细胞膜和细胞浆中观察到了特异性的黄绿色荧光，证明表达产物具有特异性。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(12):2322-2329
旨在鉴定鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)中的crp基因,并探究该基因与菌株毒力的关系,了解crp基因突变株的免疫保护效力,为开发新型R.anatipestifer减毒活疫苗奠定基础。采用P-BLAST在R.anatipestifer蛋白质组中搜寻与沙门菌crp基因相似的蛋白基因,发现R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因与沙门菌crp基因相似度为45%;将B739-0373基因克隆到表达载体上,并回补到沙门菌Δcrp突变株中,利用麦芽糖-麦康凯培养基颜色反应对其糖代谢功能进行鉴定,结果发现该基因可完全回补沙门菌自身crp的缺失,推测R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因具有类似沙门菌crp基因的功能;利用同源重组和自杀质粒,构建R.anatipestifer CH-1Δcrp突变株,比较野生及突变株的生长情况和毒力(包括黏附率、侵染率、LD_(50)、在雏鸭肝脑中的定殖能力),结果表明,crp基因的缺失使菌株生长变得缓慢,黏附力(P0.01)和侵染力(P0.001)显著下降,对雏鸭的半数致死量(LD_(50))显著提高,在雏鸭肝脏、脑中定殖能力也显著下降(P0.01);在CH-1Δcrp突变株免疫雏鸭后7,14,21 d,检测雏鸭血清中IgG水平,并以R.anatipestifer野生株对免疫后的雏鸭进行肌注攻毒,观察其临床症状和免疫保护率,发现Δcrp突变株能刺激雏鸭产生高水平的IgG抗体(P0.01),对雏鸭的免疫保护率为100%。综上表明, B739-0373基因鉴定为R.anatipestifer CH-1株的类似crp基因,可全局调控该菌株的生长和毒力;安全剂量的CH-1Δcrp突变株可诱导雏鸭产生较强的免疫保护效力,可作为新型减毒活疫苗的候选菌株。 相似文献