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1.
以抗花叶病毒病品系东农8143为材料,利用抑制消减杂交技术构建了一个大豆花叶病毒接种初期的cDNA文库,共获得2000个阳性克隆。随机挑取64个阳性克隆测序,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较,其中49个有比较明确的比对结果,占测序EST的76.6%。测序的ESTs片段中最短的为136 bp,最长的691 bp,平均长度为456 bp,有41条序列带有Poly(A)尾。功能已知基因的EST涉及大豆的细胞自身保护、信号传导、抑制病原菌生长、系统获得性抗性以及持家基因等许多方面,其中SAR（Systemic aquired resistance）系统基因在表达谱中的种类和数量最多。未知功能ESTs与GenBank的dbEST库中序列比较表明,其中许多与生物、非生物胁迫cDNA文库来源的ESTs同源。 相似文献
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利用抑制性消减杂交技术分离草莓抗炭疽病相关基因 总被引：1，自引：1，他引：0
利用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）,比较接种炭疽病菌与未接菌草莓之间的基因表达差异,筛选抗草莓炭疽病菌的差异表达基因片段,为草莓抗炭疽病遗传育种提供理论依据。分别提取接种草莓与未接种草莓叶片的总RNA,分离mRNA,逆转录成cDNA,利用Rsa I进行酶切,然后以接种叶片酶切cDNA为试验方（tester）,以未接菌草莓叶片酶切cDNA为驱动方（driver）,构建了草莓抗炭疽病基因消减文库。菌落PCR结果表明,插入片段大部分在100~1000 bp之间,文库质量好。对文库中1500个阳性克隆进行测序,共得到了1377个有效的ESTs序列。利用NCBI数据库进行Blast同源性比较发现,这些ESTs可能与胁迫反应、信号转导、蛋白合成、蛋白相互作用、物质代谢、跨膜通道、转录因子、金属转运及未知或假定蛋白等有关,ESTs序列的获得为后续草莓抗炭疽病相关基因的克隆、表达和转基因研究提供了参考。 相似文献
3.
本研究利用NCBI的GenBank数据库中公布的花生86 132条EST序列以及利用高油酸品种E12所创建的cDNA文库中的12 501条EST序列,对这些序列进行前期处理,总共获得非冗余且拼接较长的singleton 11 260条,contig 9 972条.通过MISA软件分析发现两个EST库中共包含有3 104个SSR位点,占到总共非冗余序列的11.08%.这些SSR位点被分成二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复以及混合核苷酸重复等,其中三核苷酸重复占的比例最多,分别占到NCBI和cDNA文库的43.0%和56.8%,二核苷酸和五核苷酸重复占到所有重复位点的第二位和第三位,六核苷酸重复的比例最少.在所有重复基序中,AG/TC重复的数量最多,分别占到NCBI和cDNA文库的8.65%和13.42%.在三核苷酸重复中,CTT/GAA出现的频率最大,分别占到6.7%和13.42%.所有这些SSR基序的长度在4～51个之间. 相似文献
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为了进一步研究棉花体细胞胚胎发生的分子机制,采用RNAi技术,利用棉花生物学国家重点实验室在表达载体p BI121的基础上成功改造的双元表达载体pCRI1210,构建了针对棉花胚性愈伤组织抑制性消减文库中上调表达的4个ESTs干涉载体pCRI210-EST(EST-418、EST-447、EST-496和EST-653)。以从中棉所24中筛选出的体细胞胚胎分化率较高的株系W10的无菌苗下胚轴切段为受体,利用农杆菌介导法转化pCRI1210-EST干涉载体,浸染后的下胚轴切段在愈伤组织诱导培养基上进行分化。利用半定量RT-PCR技术检测愈伤组织的cDNA。结果表明,转化4个ESTs干涉载体后的胚性愈伤组织中均检测到了载体骨架,证明干涉载体均成功整合进了基因组DNA中,而4个ESTs对应的cDNA的表达量均出现不同程度的下调,不同干涉载体转化的下胚轴出愈率呈现上升和下降2种结果。其中转化EST-418干涉载体的下胚轴出愈率与对照相比有所提高,转化EST-447、EST-496和EST-653干涉载体的下胚轴出愈率与对照相比出现不同程度的下降。因此推断,4个ESTs在愈伤组织分化过程中发挥着不同的作用。其中,EST-418在棉花体细胞胚胎发生过程中起抑制作用,而EST-447、EST-496和EST-653国外品种中在棉花体细胞胚胎发生过程中起促进作用,其结果为分离棉花体细胞胚胎发生相关基因提供了技术和理论支撑。 相似文献
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《分子植物育种》2015,(7)
目前基于梨属植物基因组开发的SSR引物太少,远不能满足其品种鉴别、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等研究与应用的需要。为进一步开发更多的梨SSR引物,本研究从NCBI公共数据库检索到梨的4 338条ESTs和478条基因组序列。通过前处理和聚类去冗余后得到全长为343.81 kb的无冗余的686条ESTs,搜索获得725个SSRs,其平均长度为17.34 bp。在一至九个核苷酸的重复基元中,其主要类型是单核苷酸重复和二核苷酸重复,两者所占的比例分别为84.44%和10.34%。BLASTx同源性比较分析发现,上述686条ESTs中305条在数据库中可以找到同源序列,占ESTs总数的44.46%,功能已知蛋白质中碧桃来源的ESTs所占比例最大,为41.37%。GOA功能分类结果表明,293条ESTs可划分为生物过程、分子功能和细胞成分3大功能类,其中与细胞过程相关的ESTs数量最多,为103条。序列分析结果显示,EST-SSRs与基因组SSRs的平均检出频率分别为2 108.74 loci/Mb和91.11 loci/Mb,两者具有显著的差异。本研究基于梨的EST和基因组序列,应用MISA批量开发技术分别获得了111对EST-SSR引物和291对基因组SSR引物,随机抽取及合成11对引物的验证结果表明,开发得到的SSR引物在梨属植物中具有较好的通用性。 相似文献
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杉木茎段皮层cDNA文库构建及EST分析 总被引：3，自引：0，他引：3
在利用ZAP Express cDNA试剂盒构建杉木茎段皮层cDNA文库,随机测序共获得1119条有效序列。利用Sequencher 2.0 Demo软件对EST进行聚类分析与拼接,共获得354个非重复序列（UniGenes）,其中包括129个重叠群（contigs）（占36.44%）和225个独立ESTs（singletons）（占63.56%）。BlastX比对发现仅有16.4%UniGenes和数据库中至少1条序列是高度相似、19.8%为中度相似、14.1%低度相似,而有近50%在数据库中无匹配序列。基因注释发现文库中表达量较高的特征基因有ARP（auxin-repressed protein）、金属硫因蛋白（metallothionein-like protein,MT）、bZIP转录因子。其中ARP（auxin-repressed protein）是值得关注的基因片段,它可能与杉木分枝及茎的伸长有关。 相似文献
7.
ESTs数据库的发展为分子标记的开发提供了宝贵的资源。本研究从NCBI下载与杨树木质部形成相关的5359条ESTs序列,在其中257条序列中检测到279个SSRs位点,检出率为5.2%。全部SSRs共分为84种重复单元,平均长度18.2bp,变幅为15～36bp,平均分布频率1/6.94kb。所有类型中三核苷酸重复单元占总SSRs的41.3%,处于主导地位。AAG占三核苷酸重复单元的比例为27.0%,是三核苷酸重复单元中的优势重复类型。利用primer3在线设计引物,通过生物信息学方法筛选出7对引物,其中6对扩增效果较好。利用筛选出的引物对19个杨树无性系进行扩增,每对引物产生多态性条带数目为3～6条,平均4.16条。引物多态信息量变化范围为0.2267～0.9845,平均0.5485。应用NTSYS软件在相似系数为0.68水平可将19个杨树无性系准确聚类。研究结果表明,利用ESTs序列进行SSRs的开发是一种切实有效的方法,为EST-SSRs在杨树遗传图谱构建以及遗传多样性等方面的应用奠定了基础。 相似文献
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小麦和水稻auxin基因家族的生物信息学比较分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据测序获得的1条260 bp cDNA片段,通过预测发现其包含小麦植物生长素(AUXIN)基因的部分编码序列,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217的cDNA中扩增获得一条608 bp的cDNA片段,该基因序列数据库(GenBank)登录号为AY902381(基因)和(蛋白).编码202个氨基酸,预计蛋白的分子量为23.0 kDa,等电点为9.93.利用已经分离的小麦生长素(AUXIN)基因的保守序列为检索序列,对小麦和水稻中的AUXIN基因家族成员进行分析,利用这些基因编码蛋白序列构建系统发生树,查找在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列,分析了这些基因在细胞中的定位情况和蛋白结构的相似性,根据已知相似基因的功能,分析该基因有进一步深入研究的必要. 相似文献
9.
为挖掘蒙古柳的NaCl胁迫相关基因,本研究利用FOX hunting system技术,构建蒙古柳cDNA连接pYES2载体后转入酵母InVSCI菌株。本研究将pYES2-蒙古柳cDNA酵母菌在1.0 mol/L Na 抗性板胁迫处理后得到15个抗NaCl胁迫的酵母菌株,并利用这15个菌株进一步通过NaHCO3、H2O2和Srobitol抗性进行分析,结果发现都表现出比对照组更强的耐胁迫性。接着对这15个菌株提取细胞DNA后克隆获得蒙古柳cDNA,在NCBI数据库中对测序得到的基因序列进行相似性比对,结果发现大部分和毛果杨基因有高的相似性,其中一些基因已有研究表明和盐胁迫相关。本研究可为挖掘可利用的耐盐基因资源提供依据。 相似文献
10.
本研究采用Gateway建库技术构建了中国芝麻主栽品种豫芝11号的植株生长发育过程中不同组织的全长cDNA文库(SiFcDNA)。该全长cDNA文库容为5.6×106,文库滴度为1.12×106 cfu/mL。部分克隆检测显示,文库cDNA片段长度集中于1.0~3.0 kb,重组率为96.88%,全长cDNA比例为88%。随机挑取1152个单克隆进行5'端EST测序,共获高质量有效EST序列1088条,拼接得到单一基因序列867条,其中46条单一基因在NCBI数据库中没有查到相应的同源序列,可能为芝麻生长发育过程特有的新基因;所获单一基因序列被划分为26个GO功能亚类。此外,从获得的Unigene序列中挖掘出了173个SSR,分布频率为4.78 kb/SSR;AG/CT类型SSR出现次数最多,占总SSR的19.08%。高质量全长SiFcDNA文库的构建为深入开展芝麻功能基因组学研究奠定基础。 相似文献
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干旱胁迫下棉花SSH文库构建及其抗旱相关基因分析 总被引：5，自引：1，他引：4
以耐旱自交系邯郸177为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH),构建棉花苗期叶片的正向差减文库。挑取300个阳性克隆进行PCR验证,并对验证后的单克隆进行测序和分析,共获得284个有效序列。聚类后得到202条uniESTs序列,其中174条singlets,28条contigs。经过BlastN分析,156个unigene可以在GenBank中找到同源序列,46个unigene未能找到同源匹配。经BlastX分析,40个unigene与未知功能蛋白或假定蛋白有较高相似性,116条unigene与已知功能蛋白有较高同源性。用KOBAS系统将33个unigene定位到55个Pathways中,其中P值小于0.5的Pathway有23条。初步分析发现, 丙酮酸盐代谢(pyruvate metabolism)途径、乙醛酸和二羧酸代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)途径与棉花抗旱相关性较大。这些unigene基因涉及信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输等代谢过程。发现了苹果酸合成酶基因(Ms1, 001_B03; Ms2, 003_E04)、苹果酸脱氢酶基因(Md1, 001_C12; Md2, 002_F01);NAC(001_C08)、锌指蛋白(zfp, 003_C06)、BZR1/BES1(003_G04)等转录调节因子,以及翻译控制肿瘤蛋白基因(TCTP,002_C04)等耐旱相关基因。 相似文献
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利用抑制差减杂交技术,分别构建小麦幼苗在水分胁迫1 h、6 h、12 h、24 h和48 h条件下的cDNA文库,得到6 733条EST序列。通过对这些序列的组装、比对、注释和分类,初步构建了小麦不同水分胁迫条件下的应答基因表达谱,发现水分胁迫应答基因表达的时间特性及4种表达模式。在648个已知功能注释的uni-gene中,6.17%属转录因子类基因,2.16%为蛋白磷酸酶类基因,4.01%是蛋白激酶类基因,19.90%为避免损伤和修复蛋白类基因,2.0%为大分子保护因子类基因,9.11%为膜蛋白类基因,这些基因可能是抗旱相关的重要基因。 相似文献
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应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱 总被引：1，自引：0，他引：1
小麦农家品种红蚰麦携带1对显性抗白粉病新基因,暂命名为Pmhym。为了深入了解该品种抗病的分子机制,用豫麦13/红蚰麦的F3代纯合抗病株系构建抗池,并对白粉菌接种后24 h的基因表达谱,采用Affymetrix小麦基因芯片进行分析,以白粉菌接种0 h为对照。在61 127基因微矩阵点中,有效差异表达Ratio值≥2或≤0.5的基因共5 282个,其中上调基因2 553个,下调2 729个。对上调序列的分类表明,功能明确的序列中39.81%与抗病/防御相关;下调表达基因中以能量代谢和抗病/防御相关基因比例最高,分别占26.71%和19.65%。上调表达在8倍以上的序列中81个的功能已知,其中包括病程相关基因、防卫反应基因、生成或清除活性氧的基因,以及抗病信号转导基因等。选取上调和下调表达8倍以上的共13个探针序列进行实时定量PCR验证,表明基因芯片数据具有良好的重复性。 相似文献
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利用斑茅cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达 总被引：2，自引：1，他引：1
为了解甘蔗抗黑穗病的分子机制,利用斑茅干旱胁迫cDNA芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达。经杂交,在cDNA芯片的3 860个模板中,有效差异表达(Ratio值≥2.0或≤0.5)的基因为101个,其中上调55个,下调46个。部分基因的定量PCR验证表明,芯片杂交结果可靠。上调表达基因经测序、冗余序列剔除,一共获得36个unique ESTs。已知功能的22个上调表达基因,涉及多条生理代谢途径,如光合作用、离子转运和核酸代谢途径;以及多种分子水平的进程,如基因转录、蛋白质合成与修饰以及细胞信号转导等。另外,还检测到14个未知功能基因。结果表明,甘蔗对黑穗病的抗性具有复杂的机制。本研究为解释甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达及其网络构建奠定了基础,还可以为今后系统研究甘蔗对生物与非生物胁迫的响应机制提供技术支持。 相似文献
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从已构建疣粒野生稻消减cDNA文库中随机挑取阳性单克隆经测序得到ESTs, 通过生物信息学分析, 选取与泛素结合酶具有同源功能的EST以RACE技术分离克隆到1个疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列, 命名为OmE2 (Oryza meyerianaBaill. ubiquitin-conjugating enzyme, OmE2), 该序列长917 bp, 最大开放阅读框为528 bp, 编码的蛋白具有175个氨基酸, 该蛋白的分子量为19.31 kD, 理论等电点为9.32。OmE2蛋白与其他物种的泛素结合酶具有高度的一致性和相似性, 含有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基, 且具有3个跨膜结构域, 推测OmE2是一类泛素结合蛋白兼跨膜蛋白。经RT-PCR分析, OmE2基因是受白叶枯病病原菌胁迫诱导表达的, 是首次从野生稻中发现的可能参与疣粒野生稻胁迫信号传导和抗病应答反应的基因。 相似文献
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小麦种质N9436抗白粉病的特异基因表达谱分析 总被引：3，自引：0，他引：3
为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制, 构建了白粉菌接种初期小麦抗性种质N9436的抑制性消减杂交文库。从文库中随机挑取140个阳性克隆, 测序结果表明, 冗余重复序列占32.86%, 其中谷胱甘肽转移酶表达频率最高, 其次为参与能量代谢的二磷酸核酮糖大小亚基。去除冗余序列和重复序列后, 得到94条EST, 利用NCBI的BLAST在线序列比对工具对GenBank的核酸和蛋白质数据库进行同源性比对和功能分析。BlastX比对结果表明, 有49条EST与已知功能蛋白同源性较高, 主要涉及抗病与防御(包括生物及非生物胁迫)、能量代谢、细胞结构、蛋白质合成及加工、转运及信号转导等过程的相关蛋白。BlastN比对NCBI的非冗余核酸数据库, 其中69条序列与EST数据库中的Unigene具有较高的同源性, 20条与EST数据库中的同源性较高, 另外5条序列找不到同源序列。通过对核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析发现, 比对结果一致的序列有33条, 涉及白粉病抗性的相关蛋白22个, 其中与抗病信号传导相关的蛋白6个, 过敏性坏死反应(HR)体系表达蛋白2个, 系统获得性抗性(SAR)体系病程相关蛋白4个, SAR体系诱导防卫蛋白10个。 相似文献
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擎天凤梨花器官全长cDNA文库的构建及EST分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了通过基因工程手段来培育花色丰富、花型奇特的擎大凤梨新品种,从擎天凤梨中筛选出花色、花型相关调控基因则是十分必要的.本研究以擎天凤梨属品种Ostara为材料,采用SMART技术成功构建了擎天凤梨花器官的质粒型全长cDNA文库,初始文库滴度为3×10~6,插入片段平均长度大于1 kb;随机挑取2004个阳性克隆进行5'EST测序,获得高质量序列1 758条,经拼接获得1 365条单基因簇(unigene),其中跨叠群(contig)175个和单条序列(singlet)1 195个;经ORF寻找共获得有效ORF 1 283条;经COG分析EST序列编码的蛋白质被分为22类;经Blast分析后,获得一批花色、花器官发育、花期调控以及其它育种价值基因(包括cDNA全长或片段).该研究结果为擎天凤梨的花色、花型转基因等育种奠定了基础. 相似文献