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1.
[目的]研究Asia Ⅰ口蹄疫病毒组合基因P1-2A3C在不同家蚕品种中的表达,以期筛选出较适合表达该组合基因的家蚕品种.[方法]将已经获得高效表达的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)基因,分别注射原种及杂交家蚕蚕蛹.利用ELISA方法对其进行抗原表达量检测,并对表达结果进行差异比较.[结果]不同家蚕品种对rBmNPV(P1-2A3C)的表达存在着明显差异;秋丰×TQ78和秋丰×丝胶茧杂交组合可考虑作为高效表达的家蚕生物反应器专用品种.[结论]为Asia Ⅰ FMDV目的蛋白的高效表达专用品种的选育提供了依据. 相似文献
2.
C型口蹄疫病毒型特异性抗原的表达与鉴定 总被引：2，自引：1，他引：2
[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备和FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其c端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其c端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接EHSA,分别对0、A、C、Asia1四型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPR0-CVP1、pPR0-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33kD和20kD。Westernblot显示,VP1及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDV阳性血清均未发生交叉反应,且以VP1C端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。 相似文献
3.
从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料. 相似文献
4.
[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备及FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其C端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其C端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接ELISA,分别对O、A、C、Asia14型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPRO-CVP1、pPRBO-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33和20kD。Westernblot显示。VPl及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDv阳性血清均未发生交叉反应。且以VP1c端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。 相似文献
5.
利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
6.
[目的]研究Asia I口蹄疫病毒组合基因P1-2A3C在不同家蚕品种中的表达,以期筛选出较适合表达该组合基因的家蚕品种。[方法]将已经获得高效表达的重组家蚕杆状病毒rBmNPV（P1-2A3C）基因,分别注射原种及杂交家蚕蚕蛹。利用ELISA方法对其进行抗原表达量检测,并对表达结果进行差异比较。[结果]不同家蚕品种对rBmNPV（P1-2A3C）的表达存在着明显差异;秋丰×TQ78和秋丰×丝胶茧杂交组合可考虑作为高效表达的家蚕生物反应器专用品种。[结论]为AsiaΙFMDV目的蛋白的高效表达专用品种的选育提供了依据。 相似文献
7.
以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。 相似文献
8.
为构建并表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的空衣壳蛋白的重组杆状病毒并鉴定其抗原性.以质粒pMD19-P12A3C为模板,扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因,插入至杆状病毒转移载体pFast-BacDual PH启动子下,构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C,并转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,构建重组转座子Bacmid-P12A3C,将其转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C.增殖重组杆状病毒然后用其感染Sf9细胞,最后通过间接免疫荧光检测外源蛋白的表达.结果表明,表达产物能够被O型FMDV VP1多克隆抗体识别,并具有良好的反应原性,表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功.该研究为进一步研究O型FMDV空表壳的体外组装提供前期实验材料,并为后期研制出口蹄疫的基因工程亚单位疫苗奠定基础. 相似文献
9.
采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C. 相似文献
10.
AsiaⅠ型口蹄疫病毒江苏分离株VP1基因的克隆与高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】实现牛口蹄疫病毒AsiaⅠ型江苏分离株VP1基因在大肠杆菌中的表达,为VP1蛋白的深入研究奠定基础。【方法】根据GenBank公布的AsiaⅠ型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)核苷酸序列(登录号:AF030244),设计并合成1对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出牛AsiaⅠ型FMDV江苏分离株VP1基因,将其连接入pMD18-T载体,测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-VP1。阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳,利用West-ern-blot分析表达蛋白的抗原性。【结果】牛AisaⅠ型FMDVVP1基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物的相对分子质量约为43 ku,并能被牛AsiaⅠ型FMDV阳性血清识别,有一定的生物学活性,表达量约占菌体蛋白总量的37.7%。【结论】牛AsiaⅠ型FMDVVP1基因表达成功,且表达产物具有一定的生物学活性。 相似文献
11.
[目的]通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持.[方法]以含A型FMDV VP1基因的重组质粒pMD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21 (DE3)中诱导表达融合蛋白.[结果]诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His· Bind和GST· Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应.[结论]经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查. 相似文献
12.
O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达 总被引：8，自引：0，他引：8
以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好． 相似文献
13.
应用PT-PCR扩增C型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体中,并对克隆载体和VP1基因进行序列分析。将VP1基因和选择标记基因——二氢叶酸还原酶（dhfr）基因插入真核表达载体pCI-neo中,对所构建的重组真核表达载体进行PCR扩增、酶切鉴定和序列分析。结果表明,VP1基因与GenBank中标准毒株（登录号EU553893）VP1的序列同源性为92.8%,VP1基因的真核表达载体pCI-VP1-D构建成功。 相似文献
14.
为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。 相似文献
15.
研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达. 相似文献
16.
为获得具有活性的A型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白,以重组质粒pUC57-MM-VP1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV VP1基因片段,并将该片段插入原核表达载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-MM-VP1;之后将该质粒转入E.coli BL21(DE3)进行诱导,同时对诱导温度进行了优化。SDSPAGE显示,最佳诱导温度为18℃,VP1蛋白主要以包涵体形式高效表达;为了提高VP1蛋白可溶性表达,将重组质粒pET-28a-MM-VP1与pTF16共同转入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,并对表达条件进行优化。结果表明,分子伴侣有效提高了A-VP1重组蛋白的可溶性表达量,诱导最佳条件为18℃、0.1 mmol·L~(-1)IPTG、2 g·L~(-1)阿拉伯糖、诱导时间20 h。Western-Blot结果表明,得到的重组蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,反应原性良好。 相似文献
17.
[目的]研究AsiaI口蹄疫病毒组合基因P1-2A3C在不同家蚕品种中的表达,以期筛选出较适合表达该组合基因的家蚕品种。[方法]将已经获得高效表达的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)基因,分别注射原种及杂交家蚕蚕蛹。利用ELISA方法对其进行抗原表达量检测,并对表达结果进行差异比较。[结果]不同家蚕品种对rBmNPV(P1-2A3C)的表达存在着明显差异;秋丰×TQ78和秋丰×丝胶茧杂交组合可考虑作为高效表达的家蚕生物反应器专用品种。[结论]为AsiaIFMDV目的蛋白的高效表达专用品种的选育提供了依据。 相似文献
18.
19.
将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。 相似文献
20.
含O型FMDVP1-2A、3CC基因和EGFP基因表达盒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMDI8-T载体,分别得到重组载体pUCll9-P1-2A和pMDI8-T-3C;将重组载体pUCll9-P1-2A用HindⅢ、BamH I酶切,重组载体pMDI8-T-3C用BamH I、Nhe I酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamH I酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMDI8-T-P1-2A-3C.,将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C. 相似文献