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1.
为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/PtufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2021,(1)
为了提高猪链球菌(Streptococcus suis,SS)05ZYH33菌株中分选酶A(Srt A)的表达量,本研究利用同源重组技术,将强启动子P_(eno)、Srt A基因与红霉素抗性基因融合并转化05ZYH33野生菌株(05ZYH33-WT),构建SS Srt A提高表达的突变株05ZYH33-srt A~e,并对05ZYH33-srt A~e突变株和05ZYH33-WT进行生长特性分析和Srt A蛋白的western blot检测;进一步构建SS Srt A基因缺失株05ZYH33-srt A~Δ作为对照,通过检测05ZYH33-WT、05ZYH33-srt A~e和05ZYH33-srt A~Δ菌株表面蛋白SSU05_0630的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的活性,初步评价Srt A的提高表达在SS表面蛋白锚定中的作用。Western blot结果显示,正确构建了SS Srt A提高表达的突变株05ZYH33-srt A~e,且该菌株的生长速度和05ZYH33-WT基本相同,但Srt A的表达量却提高了2.4倍。菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性检测结果显示,05ZYH33-srt A~Δ菌株的NAG活性和本实验室前期构建的SSU05_0630基因缺失株ssu05_0630~Δ相同,检测不到SSU05_0630蛋白的NAG活性,表明SSU05_0630蛋白是Srt A的底物,通过Srt A锚定到SS的表面。05ZYH33-srt A~e和05ZYH33-WT菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性无明显差异,即Srt A表达量的提高并没有提高SSU05_0630蛋白在SS表面的锚定量。本研究首次构建了提高SS Srt A表达量的突变株,并对Srt A表达量的提高是否对SS表面蛋白锚定产生影响进行了初步探究,为进一步研究Srt A表达量的提高对SS其他表面蛋白锚定量的影响,以及优化SS表面蛋白展示系统奠定了基础。 相似文献
3.
为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis) A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP) gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b (GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western bl... 相似文献
4.
2型猪链球菌强毒株与非致病株胞外蛋白的比较蛋白质组初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立2型猪链球菌(S.suis 2)胞外蛋白组双向电泳样品的制备方法,本研究利用双向电泳(2-DE):分离S.suis 2强毒株与无致病株的胞外蛋白,分别得到它们的胞外蛋白图谱.在pH4～pH7范围内采用考马斯亮蓝R350染色法在2菌株的胞外蛋白质图谱中都分别检测出180±10个蛋白点.并且它们的蛋白质分子质量分布基本相似;在所检测到差异蛋白点中,其中有50个蛋白点只存在于无致病菌株中而强毒株中不存在,有52个蛋白点只存在于强毒株中而无致病菌株中不存在,有7个蛋白点在2菌株中的表达量相差5倍以上.我们在强毒株凝胶中挑取了10个差异蛋白点进行质谱分析,通过数据库检索,鉴定了其中的9个蛋白,另外1种与鞭毛蛋白有同源序列.这些结果为研究S.suis2的致病机理提供了蛋白质组学方面的信息. 相似文献
5.
绿色荧光蛋白（GFP）基因和新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因被广泛应用于植物的遗传转化中。为了研究融合标记基因NPTⅡ::GFP在柑橘遗传转化中的筛选效率，本实验将CaMV35S组成型启动子驱动的nptⅡ∷GFP融合标记基因表达载体pNGM和由CaMV35S启动子分别驱动NPTⅡ、GFP两个基因的表达载体pNPTII-GF经农杆菌介导法转化锦橙上胚轴。GFP绿色荧光检测结果显示，GFP在转NPTⅡ∷GFP融合基因植株中强烈表达，荧光强度与非融合GFP转基因植株的表达水平相当。NPTⅡ∷GFP融合标记基因对锦橙的转化效率为10.8%，与非融合NPTⅡ基因的转化效率（11.0%）没有明显差异。研究结果表明，NPTⅡ∷GFP融合标记基因是一个有效的柑桔遗传转化筛选标记基因。 相似文献
6.
为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。 相似文献
7.
猪链球菌的分离鉴定及其致病性分子基础研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为调查猪源链球菌(S.suis)血清型的流行特点、主要毒力基因的分布及致病力情况,本研究针对来自我国部分地区800份疑似S.suis发病猪的病料样品进行S.suis的分离鉴定、血清型分型、致病力试验及主要毒力基因型检测。研究结果显示,在800份样品中分离到41株S.suis(5.13%);其中,血清型2型或1/2型S.suis 10株(24.4%),3型6株(14.6%),8型3株(7.3%),9型7株(17.1%),21型1株(2.4%),未定型14株(34.1%);致病力试验结果显示,以1×108 cfu/mL S.suis菌液接种昆明小鼠,41个分离株中具有致死性的菌株19株,其中6株致死性较强,13株致死性较弱;毒力基因检测结果显示gdh、fbps、orf2、gapdh、sly、ef和mrp基因的检出率分别为100%、82.9%、75.6%、41.5%、39.0%、19.5%和12.2%,以gdh+orf2+fbps+gapdh型(9株)、gdh+orf2+fbps型(8株)和sly+gdh+orf2+fbps+gapdh型(6株)为主要的毒力基因型。本研究结果揭示了我国S.suis各血清型的流行情况,初步探明S.suis致病力的强弱,为深入开展S.suis防控技术研究及其致病机理奠定了基础。 相似文献
8.
猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)感染长期困扰我国养猪业的健康和可持续性发展，尤其耐药性菌株的出现阻断原本的链球菌病防治策略。针对近年来国内外S.suis的耐药性流行情况的总结，可以为防治S.suis感染提供有效措施。因此，作者首先总结近五年来在国内外多个地区规模化猪场S.suis感染情况(阳性率普遍>40%),其中我国各省市中流行范围最广的是血清2型菌株。随后，作者归纳了猪场中耐药性S.suis流行现状及其感染特点，发现规模化猪场中的耐药性S.suis集中出现在亚洲大陆以及欧洲且多数地区耐药性高达80%以上，以四环素类耐药菌株为主。而我国规模化猪场中耐药性S.suis主要以四环素类和大环内酯类耐药为主。此外，S.suis是人畜共患的病原，可以经呼吸道和血液造成全身感染。最后，针对S.suis菌株变异多的特点，作者提出了精准检测对于防控S.suis感染的重要性并总结了目前常用的快速检测手段。强调以疫苗接种为主的防控手段和联合用药及宿主导向的新型抗菌药物研发的防治措施，为后续S.suis的耐药性菌株感染的防治提供数据支撑。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2015,(6)
为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)作为示踪标记的重组禽肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)并鉴定其遗传稳定性,本研究通过重叠延伸PCR构建5'端含有T7启动子和核糖体结合位点(RBS),3'端含有T7终止子序列的增强型GFP(e GFP)表达盒,并将e GFP表达盒插入p MD18-T载体中构建p MD-e GFP原核表达重组质粒,将其转化于S.enteritidis。结果显示e GFP能够在S.enteritidis中持续表达。进一步将S.enteritidis hil A基因两端的51 bp序列分别添加到p MD-e GFP中e GFP表达盒的两端,构建p MD-He GFP重组质粒。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析与p MD-e GFP相比,p MD-He GFP转化S.enteritidis后,其e GFP的荧光强度提高约30倍。通过在无抗生素选择压力下连续传20代次,重组S.enteritidis中e GFP仍然能够稳定表达。本研究结果为进一步研究S.enteritidis在动物体内的分布和定植规律等提供了一种具有荧光示踪标记的目标菌,并为其他细菌的同类研究提供了借鉴。 相似文献
10.
前期研究表明细菌胞外溶质结合蛋白家族5 (SBP_ bac_5)基因在猪链球菌7型(S.suis 7)型强毒株WC0711中表达量高于弱毒株M13中,推测SBP_ bac_5为S.suis7型强弱毒株差异性表达蛋白.为进一步证实该结果,本研究采用real-time RT-PCR技术在基因水平检测S.suis7型强弱毒株中SBP bac_5 mRNA的表达量差异,结果显示,强毒株WC0711中SBP bac 5的mRNA表达量为在弱毒株M13中的4.59倍.将SBP bac 5的PCR产物克隆于pET-30a中,通过E.coli BL21诱导表达,纯化后的蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清检测S.suis强弱病毒株中SBP bac 5的表达量差异.结果显示,重组蛋白获得高效表达,S.suis 7型强毒株WC0711中SBP bac 5表达量是弱毒株M13的3.8倍. 相似文献
11.
探究肠炎沙门氏菌菌蜕(ghost)佐剂对结核分枝杆菌(MTB)4种抗原的免疫增强作用,本研究以MTB中的Rv3802、Rv0394c(SEC)、Rv0199及E6c10(ESAT6与CFP10融合蛋白)蛋白为免疫原,应用小鼠模型评价沙门氏菌菌蜕对MTB4种抗原的免疫佐剂效应。结果显示,蛋白加菌蜕佐剂组可以刺激小鼠产生持久高水平的抗体,并且菌蜕佐剂的免疫增强效果高于弗氏不完全佐剂;IgG1/IgG2a的比率增高,提示蛋白加菌蜕佐剂组小鼠趋向于Th2型免疫反应,同时可以诱导淋巴细胞分化为CD4+T细胞亚群并产生IFN-γ及IL-4细胞因子;病理组织学显示以菌蜕佐剂配伍蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的安全性。本研究为结核病的预防和新型疫苗的研发奠定了一定的基础。 相似文献
12.
为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。 相似文献
13.
为研究猪白介素21(IL-21)的生物学功能,本研究在猪IL-21基因(456 bp)的3’端加上猪Ig G Fc标签序列后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。将该重组质粒转染293T细胞瞬时表达后,利用protein A亲和纯化介质纯化转染上清中的目的蛋白,并检测其纯度与生物学活性。结果显示,构建的重组质粒pcDNA-IL-21-Fc能够在293T细胞中表达相对分子量约为44 ku的猪IL-21融合蛋白;亲和纯化后的猪IL-21融合蛋白能够与CD40L协同呈剂量依懒性地刺激猪外周血淋巴细胞(PBMCs)分泌Ig G。本研究为进一步探究猪IL-21在适应性免疫应答中的作用提供依据。 相似文献
14.
试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38 EID50)接种鸭源NDV强毒株(Md/CH/LGD/1/2005),对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4d采血1次,直至24d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高(P<0.05);感染后48h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调(P<0.05);感染后48h法氏囊中白细胞介素6(IL-6)和脾脏中干扰素γ(IFN-γ)的表达量明显低于感染后24h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。 相似文献
15.
为研究化学小分子SRC抑制剂PP1和PP2对鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染宿主细胞的影响,本研究将ILTV接种鸡细胞系LMH作为研究模型,检测了PP1和PP2对ILTV感染各阶段的作用。结晶紫染色结果显示,ILTV感染细胞中,与DMSO处理组相比,PP1和PP2处理组的细胞死亡均明显增多,表明PP1和PP2促进了ILTV感染介导的宿主细胞死亡;高内涵细胞筛选检测分析结果显示,在病毒感染24h时,PP1和PP2处理组EGFP荧光面积显著大于对照组(p<0.05),表明PP1和PP2可以促进ILTV的扩散,并且该现象不受ILTV中和抗体的影响,提示PP1和PP2可以促进ILTV的细胞-细胞间扩散;病毒特异性qPCR检测显示,PP1和PP2处理组的病毒基因组拷贝数与DMSO对照组相比无显著差异,PP1和PP2处理组之间的病毒基因组拷贝数也无显著差异(p>0.05),PP1和PP2对病毒复制无显著影响。为了进一步确定PP1和PP2促进ILTV细胞-细胞间扩散的具体作用方式,本研究利用多种颜色及理化性质不同的染料对LMH细胞膜、细胞质以及ILTV囊膜分别进行染色检测,结果显示PP1和PP2能够促进ILTV进入细胞,但对ILTV吸附细胞和细胞间胞质直接联系无显著影响。本研究初步确定了PP1和PP2影响ILTV感染的具体作用方式,为对其进一步分子机制研究奠定了基础。 相似文献
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为降低单克隆抗体(MAb)在犬体内的免疫原性,本研究克隆了具有中和猫、犬细小病毒(FPV、CPV)活性的MAb(3EB)的轻、重链可变区基因及犬天然抗体(NAb)轻、重链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-犬嵌合抗体基因。构建能够表达嵌合抗体的重组质粒,经昆虫杆状病毒表达系统对重组嵌合抗体进行表达。SDS-PAGE和western blot试验显示鼠-犬嵌合抗体重链为55ku、轻链为25ku。间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗犬IgG和FPV特异性结合。上述结果表明,嵌合抗体保留了原MAb3EB对病毒特异结合能力的基础上,将鼠源恒定区替换为犬源NAb的恒定区。病毒中和试验表明嵌合抗体保留了3EB对FPV、CPV的中和活性。本研究首次通过昆虫杆状病毒表达系统表达了抗FPV、CPV的嵌合抗体,降低了原MAb的免疫原性,对FPV、CPV病临床治疗用抗体药物的研制具有重要指导意义。 相似文献
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为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。 相似文献