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1.
《中国兽医学报》2019,(6):1118-1124
为了研究重组腐败梭菌α毒素的生物活性及其灭活疫苗的免疫效果,采用PCR法扩增腐败梭菌α毒素基因,构建重组表达质粒pET28α-csa,转化E.coli BL21(DE3);对表达产物的细胞毒性、小鼠致死毒力和抗毒素中和试验等生物活性进行鉴定,并将其制成灭活疫苗免疫家兔和靶动物绵羊,通过攻毒素试验和血清中和试验与类毒素疫苗进行比较。结果显示,重组α毒素能够与腐败梭菌抗毒素血清反应,具有细胞毒性,小鼠致死毒力超过300 MLD/mL,其毒性可以被腐败梭菌抗毒素中和。制成灭活疫苗免疫家兔,随着免疫剂量的增加血清中和效价随之提高,0.25 mL/只(含重组α毒素0.11 mg)免疫即可使家兔获得100%保护,免疫效果优于类毒素疫苗;0.50 mL/只(含重组α毒素0.22 mg)免疫绵羊攻毒保护率为75%。结果表明,重组腐败梭菌α毒素具有很好的生物活性,所制成的灭活疫苗可以作为预防羊快疫的候选疫苗。 相似文献
2.
为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。 相似文献
3.
本研究旨在获得重组C型肉毒梭菌毒素蛋白,并评价其免疫保护性。将麦芽糖蛋白（MBP）和C型肉毒梭菌毒素重链C末端（CHC）的编码基因序列进行优化和串联,获得基因片段GMBPCHC。将GMBPCHC克隆至pET28a-（＋）后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在15和37℃两种温度条件下诱导表达。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rMBPCHC。将rMBPCHC与Montanide ISA 201佐剂混合制备成疫苗,免疫4只家兔,剂量为100 μg/只。根据《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测一免后21 d及二免后14 d家兔血清的中和抗体效价。同时,在二免后14 d对家兔进行攻毒。结果表明,rMBPCHC在37℃的诱导温度下,主要以包涵体的形式表达;在15℃的诱导温度下,可溶性表达的比例可达50%。一次免疫后,免疫组4只家兔血清对C型肉毒梭菌天然毒素（简称天然毒素）的中和效价均可达到1（0.1 mL血清中和1个小鼠最小致死量（MLD）的天然毒素）。二免后,家兔血清的中和抗体效价可达到4~8。用10个家兔MLD的天然毒素攻毒后,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护,而用1个家兔MLD的天然毒素攻毒后,对照组家兔100%（2/2）死亡。以上结果说明,rMBPCHC具有良好的免疫原性,从而为C型肉毒梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。 相似文献
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本研究旨在获得腐败梭菌无毒重组α毒素,并评价其免疫保护性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计和人工合成,获得了缺少第212-222位共11个氨基酸编码序列的基因片段（GCSAΔ11）。将该基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中进行表达与纯化。利用Western blot方法检测获得的重组α毒素（rCSAΔ11）与腐败梭菌天然毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测其毒力。随后,以rCSAΔ11制备疫苗免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSAΔ11可溶表达比例可达46%,且能与腐败梭菌天然毒素抗血清反应。进一步的试验结果显示,rCSAΔ11丧失了对小鼠的毒力,0.1 mL的一免兔血清可中和8~12个小鼠最小致死量（MLD）的腐败梭菌天然毒素;二免兔血清可中和32~45个小鼠MLD的腐败梭菌天然毒素。1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护。综上表明,无毒性的rCSAΔ11保留了良好的免疫保护性,从而为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。 相似文献
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本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western blot方法检测纯化的rCSA与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用犬肾细胞系(MDCK)和小鼠来检测rCSA的毒力。以甲醛脱毒后的rCSA与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA为可溶性表达,比例可达50%,且能与腐败梭菌抗血清反应。MDCK细胞毒性试验显示,0.15ng·mL~(-1)的rCSA即可引起明显的细胞病变;小鼠安全性试验显示,rCSA对ICR小鼠的最小致死量是1.5×10~6 ng·kg~(-1);每毫升的一免抗血清可中和100~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免抗血清可中和360~480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了4/4的保护。以上结果表明,rCSA具有良好的免疫原性,可作为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的候选抗原。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(8):1500-1505
为了确定产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)和α毒素(CPA)无毒突变体作为亚单位疫苗同时预防D型和A型产气荚膜梭菌病的免疫效果,试验用点突变结合OEPR法构建重组质粒pET32a-mETX-mCPA。将阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,以预先添加乳糖的自诱导培养基表达目的蛋白。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白相对分子质量约为92 000,与预期值一致。Western blot检测结果表明,重组蛋白可被A型产气荚膜梭菌阳性血清所识别。致死性试验结果表明,重组蛋白不致死小鼠。以铝胶为佐剂将重组蛋白免疫家兔,二免血清0.1 mL可分别中和3个小鼠MLD的A型毒素和100个小鼠MLD的D型毒素。本研究用OEPR法成功构建了无毒突变体pET32a-mETX-mCPA质粒,获得的重组蛋白在家兔上显示出良好的免疫效果,为研发A、D型产气荚膜梭菌二价亚单位疫苗奠定理论基础。 相似文献
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为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(10):93-96
PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株β毒素完整成熟肽序列,将942 bp的基因片段以正确的阅读框架定向克隆于p ET-32a(+)中,然后将重组质粒转化进宿主菌BL21(DE3)中,在37℃1 mmol/L IPTG诱导下该片段获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为54.6 ku,与预期值一致。Western blot显示,该重组蛋白可被C型产气荚膜梭菌血清识别,表明该重组蛋白具备与天然毒素相类似的反应原性。重组β毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和包涵体中均有分布,且以包涵体为主,表明重组蛋白可同时以胞外、周质和胞浆的形式表达。小鼠试验表明,重组β毒素蛋白不具有毒性。毒素-抗毒素中和试验表明,该抗血清具有β毒素特异性。以重组β毒素蛋白作为抗原免疫家兔,每0.1 m L的一免、二免、三免后抗血清分别可以中和10、20、50个小鼠MLD的C型毒素。结果表明,试验所获得的重组菌株有望成为产气荚膜梭菌β类毒素生产的候选菌株,所制备的抗血清有望进一步研制成为抗β毒素国家标准品。 相似文献
11.
本试验旨在研究苯甲酸对白羽肉鸡生长性能、肠道形态及盲肠微生物的影响。试验采用单因子试验设计,选取360只1日龄的罗斯308(Ross308)白羽肉鸡,随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只。饲粮中苯甲酸的添加水平为0(对照组)、0.7%和1.4%。试验期为21d。结果表明:1)与对照组相比,添加苯甲酸对1~21日龄肉鸡的平均增重(AWG)有提高趋势(P=0.066);添加0.7%苯甲酸显著提高了1~21日龄肉鸡的平均采食量(AFI)(P<0.05)。2)与对照组相比,添加苯甲酸显著提高空肠绒毛高度和绒隐比(P<0.05),对隐窝深度无显著影响(P>0.05)。3)与对照组相比,添加苯甲酸对21日龄肉鸡空肠酶活性无显著影响(P>0.05),但从数值上看,添加0.7%苯甲酸提高了空肠酶活性。4)与对照组相比,添加苯甲酸对肉鸡盲肠微生物菌群无显著影响(P>0.05);从数值上看,添加苯甲酸降低了肉鸡21日龄大肠杆菌数量。由此得出,苯甲酸能够提高肉鸡空肠绒毛高度和绒隐比,进而在一定程度上提高1~21日龄肉鸡的生长性能,但对盲肠微生物数量没有显著影响;1~21日龄肉鸡饲粮苯甲酸的添加水平以0.7%效果较好。 相似文献
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本试验旨在研究饲粮中添加枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,BS)对石门土鸡生长性能、屠宰性能、血清抗氧化指标和肠道形态的影响。选取540只55日龄、体重[(0.75±0.02) kg]相近的健康石门土鸡母鸡,随机分成3组,每组6个重复,每个重复30只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮的基础上添加300和600 mg/kg BS的试验饲粮。预试期7 d,正试期28 d。结果表明:1) 1～14 d时,与对照组相比,300、600 mg/kg BS组石门土鸡的平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)有提高趋势(P>0.05); 15～28 d和1～28 d时,各组间的ADFI、ADG和料重比(F/G)均无显著差异(P> 0.05)。2)与对照组相比,600 mg/kg BS组石门土鸡的屠宰率显著提高(P<0.05),300、600 mg/kg BS组的腹脂率有提高趋势(P>0.05);各组间的半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率均无显著差异(P>0.05)。3)与对照组相比,14 d时,300 mg/kg BS组石门土鸡的血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著提高(P <0. 05); 14和28 d时,300、600 mg/kg BS组的血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著提高(P <0.01)。4)与对照组相比,300、600 mg/kg BS组石门土鸡的十二指肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度均有提高趋势(P>0.05),300 mg/kg BS组的空肠绒毛宽度显著提高(P<0.05);各组间的回肠绒毛宽度、隐窝深度和绒隐比均无显著差异(P>0.05)。综上,饲粮中添加BS提高了石门土鸡的屠宰性能,增强了机体抗氧化能力,改善了肠道形态。 相似文献
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为研究猪丹毒丝菌CVCC43005株作为生产用菌种的最高扩繁代次以及新型佐剂对该菌种免疫原性的影响,在对猪丹毒丝菌CVCC43005株形态、生化特性、培养特性、纯粹性、血清学特性、真空度、剩余水分含量、毒力及免疫原性等研究的基础上,建立了猪丹毒丝菌CVCC43005株种子批。将CVCC43005株(1986年冻干)用培养基进行了20次传代(F1~F20),并对其中的F5、F10、F15、F20代进行冻干并抽检测定。结果显示:抽检的各代次菌种均纯粹,形态、生化特性、培养特性均符合猪丹毒丝菌的特性,血清型为2型,真空度检查均呈现白色、粉色或紫色辉光,剩余水分含量均<3.0%,9~10CFU活菌皮下注射体重18~22g小白鼠,均于7日内5/5死亡。将抽检的各代次菌种制成铝胶佐剂灭活疫苗,免疫16~18g小白鼠后均能产生10/10保护。以F5代菌株制备菌液,甲醛灭活后,分别用铝胶佐剂、矿物质白油佐剂、洛阳赛威公司的水溶性佐剂、水性复合免疫佐剂以及法国赛比克公司的MONTANIDETMIMS1313VGNST、GEL01PR6种佐剂制备灭活疫苗,经无菌及安全检查合格后进行16~18g小白鼠免疫效果对比实验,最终确定猪丹毒丝菌CVCC43005株基础种子代数为F1~F10代,生产用菌种的最高扩繁代次宜控制在5代以内,法国赛比克公司的GEL01PR佐剂为猪丹毒灭活疫苗的最佳佐剂。该菌种作为生产用菌种最高扩繁代次的确定及疫苗佐剂的筛选,为修订菌种检定依据奠定了基础。 相似文献
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80只14日龄SPF鸡随机均分为试验组和对照组,试验组用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株人工感染,感染后5 d和7 d分别进行试验组及对照组气管黏膜扫描电镜观察,研究IBV入侵门户气管黏膜在感染IBV后的超微病变特点。结果表明:感染IBV后,气管表面纤毛集结成束,有大量黏液附着,纤毛粘连。气管黏膜结构受损,局部气管黏膜上皮脱落,固有层裸露,大量炎性细胞渗出。随感染期的延长,症状有加剧趋势。研究结果为IBV的发病机理提供了形态学上的依据。 相似文献
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针对兽医临床的细菌耐药现象,为指导临床合理用药,采用微量肉汤稀释法研究了三代大环内酯类抗生素泰乐菌素、替米考星和泰地罗新对兽医临床常见的15种共74株病原菌的体外抑菌效果。结果显示:对于革兰阳性菌,泰乐菌素和替米考星对乳房炎常见的金黄色葡萄球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌均有较强的抑菌活性,优于泰地罗新;泰地罗新对肺炎链球菌抑菌效果较强。对于革兰阴性菌,如支气管败血波氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌等致病菌,替米考星的抑菌效果比泰乐菌素强1～64倍,泰地罗新比替米考星强2～32倍。对引起肠道感染的大肠杆菌,泰地罗新亦表现出很好的抑菌活性,效果优于泰乐菌素和替米考星。本试验为畜禽细菌性疾病的防控以及大环内酯类抗菌药物的合理使用提供了基础数据。 相似文献
16.
本试验旨在研究不同氮利用率山羊瘤胃细菌结构与组成的差异。以30只山羊作为试验动物,通过代谢试验,筛选出高氮利用率组(HNU组)和低氮利用率组(LNU组)的山羊个体。屠宰采集HNU组、LNU组每只山羊瘤胃内容物,用高通量测序技术分析比较组间瘤胃细菌结构与组成的差异性,并用实时荧光定量PCR技术对7种蛋白质分解菌进行定量分析和比较。结果表明:1)30只山羊对饲料氮利用率存在明显的个体差异,HNU组和LNU组的平均氮利用率分别为(56.68±5.54)%和(34.25±4.21)%,组间差异极显著(P<0.01)。2)HNU组和LNU组瘤胃微生物的结构在属水平上有明显差异,HNU组普雷沃氏菌属1(Prevotella 1)、解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、p-1088-a5gutgroup的相对丰度显著低于LNU组(P<0.05),毛螺菌科XPB1014肠道群(Lachnospiraceae XPB1014group)、瘤胃球菌属1(Ruminococcus 1)、瘤胃球菌科UCG004(RuminococcaceaeUCG004)、瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、FamilyⅩⅢUCG002、厌氧支原体属(Anaeroplasma)的相对丰度显著高于LNU组(P<0.05)。3)相关分析显示宿主氮利用率与Ruminococcus 1、Ruminobacter、Anaeroplasma的相对丰度呈显著正相关(P<0.05)。4)HNU组中溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、产琥珀酸丝状杆菌属(Fibrobacter succinogens)和瘤胃球菌属sp.HUN007(Ruminococcussp.HUN007)数量显著高于LNU组(P<0.05),而栖息瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinisolvens)和黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)数量在2组间没有显著差异(P>0.05)。综上所述,不同氮利用率山羊瘤胃细菌的结构与组成存在显著差异。 相似文献
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以1日龄C57BL/6乳鼠作为试验对象,分别通过颅内和腹腔注射肠道病毒71型(EV71)福建株感染,观察记录小鼠体重和体征,定期采集小鼠大脑、小肠、肺、肌肉4种组织,分析病毒载量,通过HE染色和免疫组化观察各种组织病理变化。结果:2种感染途径的C57BL/6乳鼠均于不同时间出现竖毛、弓背和消瘦症状。经腹腔注射感染的乳鼠能在肌肉组织中检测到病毒RNA,经颅内注射感染的乳鼠可在肌肉和肺组织中检测到病毒RNA。病理学及免疫组化结果显示:EV71福建株在骨骼肌中大量增殖,并可导致肌肉组织水肿和坏死、肺组织水肿充血以及神经元坏死等多种组织器官炎症反应。综上,初步建立通过颅内和腹腔注射感染EV71的C57BL/6乳鼠模型,为研究EV71病毒感染机制、建立更优的动物模型提供参考。 相似文献
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本试验研究滴灌条件下紫花苜蓿种子生产适宜的种植密度和最优株行距配比,旨在为我国西北半干旱地区滴灌条件下苜蓿种子生产提供理论指导。试验以‘甘农4号’苜蓿为试验材料,研究了滴灌条件下不同株行配比和密度对产量以及产量构成因子的影响,研究结果表明：每株花序数、生殖枝数、每荚种子数和千粒重是影响苜蓿种子产量的主要因素,其中每株花序数对单株种子产量的贡献起直接作用,其余3个因子对产量的贡献主要通过每株花序数间接实现。在株行配比和产量回归拟合模型中,株行距为35 cm×100 cm时单株实际产量最高;株行距为15 cm×100 cm时单位面积实际产量最高。因此,在宁夏中部干旱带进行苜蓿种子生产时,建议采用行距为100 cm,株距为15 cm的配比。 相似文献
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microRNA(简称miRNA)是一类长约22 nt的小分子RNA,广泛存在于真核生物中,调节着生物体的诸多生理活动并与疾病的发生息息相关。大量研究发现,miRNA可以从细胞内释放,广泛而稳定地存在于包括血清、血浆、唾液、尿液、甚至牛奶等细胞外液中,统称为循环miRNA(circulating microRNA)。研究表明,在正常机体和患病机体内某些循环miRNA的表达谱存在着明显的差异,因此循环miRNA常被作为一种非侵入性、内源性新型疾病诊断标志物来研究。文章对循环miRNA作为一种新型疾病诊断标志物在动物疾病中的研究进展进行了综述。 相似文献
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本试验旨在研究马齿苋多糖对早期断奶大鼠生长性能、血清生化指标和肠道形态的影响。选取30只SD断奶大鼠,随机分为3个组,每组10只。各组大鼠均饲喂相同的饲粮,Ⅰ组(对照组)大鼠灌胃2 mL生理盐水,Ⅱ和Ⅲ组(试验组)大鼠分别按照100、200 mg/kg BW的剂量灌胃马齿苋多糖(溶于2 mL生理盐水),每日1次,连续28 d。结果显示:1)马齿苋多糖对断奶大鼠体重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI),血清尿素氮(UN)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)含量和谷丙转氨酶(GPT)活性,回肠绒毛高度、结肠长度等指标均无显著影响(P>0.05)。2)与Ⅰ组相比,Ⅱ和Ⅲ组断奶大鼠血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白(HDL)、葡萄糖(GLU)含量和谷草转氨酶(GOT)活性显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),回肠绒毛高度/隐窝深度(V/C)及结肠绒毛高度显著或极显著增加(P <0. 05或P <0.01)。3)与Ⅰ组相比,Ⅲ组断奶大鼠血清中球蛋白(GLO)、总胆固醇(TC)含量及碱性磷酸酶(AKP)活性显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),料重比(F/G)及回肠隐窝深度显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。结果提示,马齿苋多糖可提升断奶大鼠血清相关代谢酶活性,增加血清中蛋白质、胆固醇和葡萄糖的含量,促进肠道绒毛发育,降低料重比,从而改善早期断奶大鼠的生长性能。 相似文献