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1.
为明确小麦TaLr35PR2蛋白在叶锈菌和信号分子诱导下的表达模式,在前期研究工作基础上,成功构建了TaLr35PR2基因的原核表达载TaLr35PR2-pEASY,在大肠杆菌中高效表达分子量约为30kDa的融合蛋白,采用Western杂交分析了TaLr35PR2蛋白在叶锈菌、水杨酸(Salicylic acid,SA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)诱导下的表达水平。结果表明,小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2蛋白在亲和反应(Thatcher)中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应(TcLr35)中的表达量变化较大,在接种叶锈菌后不同时间点有明显的上升或下调,且在非亲和组合中的表达量明显高于亲和组合。另外,信号分子可以诱导TaLr35PR2蛋白的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,TaLr35PR2蛋白表达量显著上调。这些研究结果首次从蛋白表达水平明确叶锈菌和信号分子SA、ABA显著诱导TaLr35PR2蛋白的表达,推测TaLr35PR2可能与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应具有一定相关性。 相似文献
2.
叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中PR1基因的克隆及分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得1个病程相关蛋白1(Pathogenesis-related proteins 1,PR1)基因,暂命名为TcLr19PR1。该基因长度为810bp,包含495bp ORF区,编码164个氨基酸,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与多个植物病程相关蛋白1基因具有较高同源性。利用半定量分析表明,TcLr19PR1基因受叶锈菌诱导后表达量变化明显,非亲和组合表达高于亲和组合。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。利用‘中国春’缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上,为进一步明确叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中病程相关蛋白1基因的抗叶锈相关性奠定了基础。 相似文献
3.
小麦与叶锈菌互作过程中LRRs类基因在转录水平的表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验以小麦近等基因系TcLr26和Thatcher分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和及亲和组合,基于RNA-Seq高通量测序数据库,通过基因表达差异分析,筛选了6个在接种后较0h表达明显变化的属于LRRs类基因的Unigenes,利用实时定量PCR(RT-qPCR)技术对这6个LRRs类基因在接种叶锈菌后的表达进行了分析,为深入研究这些LRRs类蛋白在小麦抗叶锈菌侵染过程中的作用机制奠定了重要试验基础。 相似文献
4.
【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号转导基因相关,其余EST分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。RT-PCR分析结果表明同一基因在叶锈菌侵染后不同时间点的小麦叶片中表达量不一致,且各基因有不同的表达模式。【结论】推测钙转运ATP酶,谷胱甘肽-S-转移酶,蛋白激酶Pti1,NBS-LRR抗病蛋白和分子伴侣DnaJ等参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库可用于了解小麦与叶锈菌非亲和互作过程中的功能基因,为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库奠定基础。 相似文献
5.
【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。 相似文献
6.
6个小麦抗叶锈病近等基因系的cDNA-AFLP差异表达分析 总被引：3，自引：1，他引：2
应用cDNA-AFLP技术对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher间的表达差异进行分析,共选用226对引物组合对其进行筛选,检测出7 554条条带,平均每对引物可获得33条扩增条带。筛选出68对引物能够在小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher之间扩增出特异表达条带,特异表达检出率为30.1%。68对引物共扩增出84条特异表达条带,并根据基因表达与否及表达量划分为9种不同的特异表达类型(I~IX)。其中,I、V和VII型特异表达类型为组成型表达,共49条;II、IV、VI和VIII型特异表达类型表达上调,共21条;III和IX型特异表达类型表达下调,共14条。有5种特异表达类型(IV、V、VI、VII、VIII型)可能与小麦的抗病反应相关,并且这5种特异表达类型又分为两类亚型,第一类亚型是小麦抗叶锈病近等基因系与小麦叶锈菌互作时特异表达(I V型)或者表达量明显增加(VI、VIII型),为诱导性特异表达类型;第二类亚型为组成型特异表达类型(V、VII型)。 相似文献
7.
为筛选小麦叶锈病抗病相关基因,以从小麦近等基因系TcLr19中获得的特异表达的168 bp cDNA-AFLP片段为靶序列,通过cDNA末端快速扩增(RACE)的方法获得2545 bp的cDNA序列,并在接菌的TcLr19叶片中进行RT-PCR验证,测序结果与RACE结果一致.tBLASTn比对发现该序列与预测的二穗短柄草的Receptor-like protein 2-like (LOC100825532)有67％的一致性(Expect=0.0).该基因包含一个2136 bp的开放阅读框,编码711个氨基酸;SMART分析表明其含有6个LRR结构域,属LRR-TM类型,推测其为假定的富含亮氨酸的类受体蛋白基因,暂命名为TaRLP19,GenBank登录号为(JN872563).半定量RT-PCR分析表明,该基因属组成型特异表达类型.为进一步研究叶锈菌与小麦TcLr19非亲和反应中类受体蛋白TaRLP19的功能及其表达调控机制等奠定基础. 相似文献
8.
小麦病程相关蛋白1基因的亚细胞定位及信号肽鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
前期研究克隆获得了一个叶锈菌诱导的小麦病程相关蛋白1基因TaLr35PR1,明确了其基因结构和表达特征。本研究首先预测TaLr35PR1的信号肽和亚细胞定位情况,进而通过试验予以佐证。将信号肽编码的核酸序列克隆、连接到酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI上,并转化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12中,明确了TaLr35PR1基因的信号肽具有分泌功能。同时,利用酶切连接的方法成功构建亚细胞定位重组体pCamA-TaLr35PR1-GFP,利用基因枪轰击技术瞬时转化洋葱表皮细胞。结果表明,pCamA-TaLr35PR1-GFP融合蛋白主要在细胞外表达,与亚细胞定位预测的结果一致。这些研究结果丰富了小麦病程相关蛋白1基因的研究内容,为进一步探索该类基因的生物学功能及其作用机制提供了研究基础。 相似文献
9.
为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。 相似文献
10.
《江苏农业科学》2016,(1)
NBS-LRR是已克隆植物抗病基因的高度保守氨基酸区域。前期工作中,笔者成功克隆获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S2A2的cDNA序列,该序列含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域,且在小麦叶片中为低丰度组成型表达。进一步根据S2A2基因在TcLr35与Thatcher中扩增获得的基因序列差异位点设计特异性引物,分别以TcLr35、Thatcher为模板进行扩增,筛选出了具有较高稳定性和可重复性的3对引物。利用3个多态性引物对TcLr35、Thatcher及其F2代群体进行扩增和遗传性分析,并用Mapmanager软件计算分子标记与抗叶锈病基因之间的遗传距离,结果发现这3对引物获得的标记与Lr35基因遗传距离较远。利用这3个多态性引物扩增33个不同小麦抗叶锈病近等基因系材料,并回收测序,结果表明该基因序列在不同近等基因系材料中广泛存在。 相似文献
11.
【目的】获得与Lr24基因紧密连锁并可能作为探针的TRAP分子标记。【方法】应用TRAP技术,选用90对引物组合对小麦抗叶锈病基因Lr24、感病亲本Thatcher及其F2代抗感各10株组成的抗、感基因池（Br、Bs）的扩增带型差异进行分析,用筛选获得的多态性引物对TcLr24×Thatcher F2群体进一步筛选,进而用获得的特异引物对45个小麦抗叶锈病近等基因系和30个小麦二倍体材料进行分析。【结果】获得10对能够在TcLr24、Br与Thatcher、Bs间产生多态性的引物,多态性引物检出率为11.11%。其中1对在F2抗感群体中有差异且稳定扩增的TRAP引物ARBI1/RGA-2F,其161bp 扩增产物仅在F2抗病单株中出现,感病单株中缺失。用该引物对45个近等基因系和30个二倍体材料检测发现,近等基因系TcLr19、TcLr29、TcLr38、Lr42和TcLr44中有相同大小片段的扩增产物,30个二倍体材料中未出现相应扩增产物。【结论】本研究获得的一个与Lr24紧密连锁的TRAP标记,该标记可筛选含有Lr24基因的育种后代群体,可作为探针用于文库的筛选。 相似文献
12.
小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。 相似文献
13.
小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定 总被引：9，自引：5，他引：9
【目的】拟利用同源序列法分离小麦抗病基因同源片段。【方法】根据已克隆植物抗病（R）基因NBS-LRR保守区段设计两对引物，采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35 的RNA进行扩增。【结果】 获得了3个通读的小麦抗病基因NBS-LRR类抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2和S2A2，长度分别为239bp、289bp和539bp，编码78、84和177个氨基酸。核苷酸比较分析表明，PS13-1和PS13-2与已克隆小麦抗白粉病基因PM3b同源性为91%；S2A2与大麦一个来源于mRNA的同源片段同源性为91%；经BLASTp比较，3个片段均含有NB-ARC保守结构域，与已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相应区域相一致，具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2a等）。Northern杂交分析表明，3个同源片段在小麦叶片中为低丰度组成型表达。【结论】本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病基因同源序列，为最终克隆小麦抗叶锈病基因奠定了基础。 相似文献
14.
农杆菌介导瞬时沉默小麦HCP1的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立农杆菌介导的瞬时沉默小麦HCP1的方法,为简便、快速、高效地研究小麦基因功能提供一种可靠的技术支持。研究HCP1在叶锈菌侵染过程中对H2O2的清除作用,为阐明小麦抗叶锈菌侵染中信号转导机制奠定理论基础。【方法】采用农杆菌注射法,将携带有peGFP载体的农杆菌注射到小麦叶片中,观察叶片中荧光强度及分布,分析外源质粒在小麦叶片中的表达情况。通过注射EHA105、LBA4404和C58C1 3种不同的农杆菌菌株,将HCP1的RNAi载体导入小麦叶片细胞中,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测HCP1瞬时沉默效率,并结合Rohringer染色分析,明确不同农杆菌对寄主叶片侵染能力的强弱,从而筛选出最适的试验菌株。在瞬时沉默的小麦叶片上,接种不亲和叶锈菌小种260,利用DAB染色,观察接种叶锈菌后叶片中H2O2的变化,分析HCP1在小麦与叶锈菌互作过程中的功能。【结果】叶片GFP荧光观察结果说明,在注射农杆菌48 h后GFP开始出现较高表达。RT-PCR和qRT-PCR结果表明,注射C58C1菌株的叶片12 h后,HCP1的表达量开始降低,并持续保持较低的表达量。注射EHA105菌株的叶片,在注射后72-96 h,HCP1的表达量迅速降低。而注射LBA4404菌株的叶片中HCP1的表达量基本没有变化。所以在3种不同农杆菌菌株介导的HCP1 RNAi转化中,沉默效率依次为：C58C1≥EHA105＞LBA4404。注射不同农杆菌菌株叶片的Rohringer染色结果发现,EHA105侵染后引起的HR反应较其他两种菌株明显,说明EHA105对小麦叶片具有较高毒性,会引起叶片产生防卫反应,C58C1菌株在具有较高的沉默效率同时,对叶片的毒性较小,因此选取C58C1作为最适的试验菌株;沉默HCP1的小麦叶片接种叶锈菌小种260后,通过DAB染色发现,接种24 h和48 h后叶锈菌侵染诱发的小麦叶片H2O2的分布及积累量均多于对照组。【结论】建立了农杆菌介导的瞬时基因沉默体系,选用C58C1农杆菌菌株作为试验菌株,在处理后72 h可达到沉默目的基因的效果。确定HCP1参与了小麦与叶锈菌互作过程中H2O2的清除途径。 相似文献
15.
【目的】由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是影响小麦生产的主要病害之一,在小麦与叶锈菌互作的过程中病菌向寄主细胞分泌效应蛋白,以调控寄主防御反应、发挥毒性功能。开展对小麦叶锈菌效应蛋白的研究,探索小麦叶锈菌的致病机制,为病害的持续防控提供依据。【方法】以小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作的cDNA为模板扩增效应蛋白Pt18906,通过SignalP 4.1、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和EffectorP 2.0软件对Pt18906进行序列特征分析,利用在线软件Swiss-Model预测Pt18906的三级结构,利用在线软件SOPMA预测Pt18906的二级结构。采用实时荧光定量PCR对Pt18906的表达模式进行分析,借助于烟草的异源表达系统对Pt18906进行抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）能力验证,利用酵母系统验证Pt18906的信号肽是否具有分泌功能,采用氨基酸逐步缺失的方法缺失突变Pt18906,从而确定其功能毒性motif;通过在烟草中瞬时表达Pt18906-GFP融合蛋白,结合质壁分离技术分析Pt18906的亚细胞定位,得出效应蛋白的作用位点;利用瞬时表达技术在以Thatcher为背景的不含抗病基因和含有不同抗病基因的全套近等基因系上开展Pt18906无毒性功能分析;采用细菌三型分泌系统（Type Ⅲ secretion system）介导的瞬时转化分析Pt18906对寄主防御反应的调控。【结果】从小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作6 d的转录组文库中获得一个在接种24 h后显著高表达的、基因全长序列672 bp、编码223个氨基酸的候选效应蛋白Pt18906,该效应蛋白缺乏已知的功能结构域和保守基序,工作环境偏碱性,在烟草细胞中瞬时表达Pt18906,Pt18906能够抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡,表明该效应蛋白具有毒性功能,并且通过构建缺失突变体明确其28—47位氨基酸对其毒性功能具有重要作用,该效应蛋白定位于细胞核和细胞质,表明其作用于细胞内。Pt18906在单基因系抗病品种TcLr27+31和TcLr42上能够引起过敏性坏死反应,表明该效应蛋白的无毒性,Pt18906能够引起TcLr27+31中胼胝质的积累和活性氧的迸发,胼胝质随注射时间的增加而逐渐积累,活性氧在注射后的10 min达到最高。【结论】位于28—47位的氨基酸决定Pt18906的毒性主要功能,Pt18906能激发小麦TcLr27+31双层防御反应。 相似文献
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异三聚体G蛋白参与小麦抗叶锈病反应的研究 总被引：1，自引：2，他引：1
【目的】研究异三聚体G蛋白是否参与小麦抗叶锈病反应的过程,为更深入地了解小麦抗叶锈病的反应机制奠定基础。【方法】用异三聚体G蛋白的效应剂处理离体培养的小麦叶片后接种叶锈菌观察侵染型的变化。测量经异三聚体G蛋白的效应剂诱导后防卫反应酶活性值,观察变化趋势。另外用半定量RT-PCR方法检测接种毒性菌株和无毒性菌株后异三聚体G蛋白α亚基基因的表达情况。【结果】用激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后明显可以推迟叶片发病,而抑制剂百日咳毒素（PTX）作用不明显。用G蛋白的激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后防卫反应酶的活性升高,而用抑制剂百日咳毒素（PTX）处理后24 h再接种无毒性叶锈菌菌株,防卫反应酶的活性却无明显的变化。无毒性叶锈菌菌株可以诱导叶片中G蛋白基因表达量升高,毒性菌株抑制G蛋白基因的表达。【结论】异三聚体G蛋白可能参与了小麦抗叶锈病的反应过程。 相似文献