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1.
银杏HDR基因的克隆与功能分析 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能.[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为GbHDR(GenBank登录号:DQ364231),该基因cDNA全长为1 827 bp,包含1 425 bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌.[结果]克隆基因实际长度为1 441 bp的GbHDR基因,该序列包含1 425 bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2 kD,等电点预测为5.76.功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue+pTrcGbHDR+pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能.[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点. 相似文献
2.
银杏HDR基因的克隆与功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能。[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为Gb-HDR（GenBank登录号：DQ364231）,该基因cDNA全长为1827bp,包含1425bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌。[结果]克隆获得实际长度为1441bp的GbHDR基因,该序列包含1425bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2kD,等电点预测为5.76。功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue＋pTrcGbHDR＋pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能。[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点。 相似文献
3.
[目的]旨在克隆绵羊激活素受体 IIB （ActRIIB）基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总 RNA反转录得到的 cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊 ActRIIB基因的 cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体 pET41a连接,构建重组表达质粒 pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1564 bp（ Genbank登陆号为：JX422071.1）,最大开放阅读框为1539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高（99.6%）,ActRIIB的 C末端区域高度同源且属于 TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小（约92 kD）并带有组氨酸标签序列的 ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊 ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
4.
[目的]克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)基因(TcMCT),分析其功能,并检测组织表达特异性,为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据.[方法]采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TcMCT基因的组织表达模式,并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能.[结果]克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp,开放阅读框(ORF)为942 bp,编码313个氨基酸.TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点,但在N端氨基酸序列保守性较差,其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为59.3%.TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似,均属于同源二聚体.TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽,且以Arg88作为切割位点,定位于叶绿体中.TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达,在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根,在茎和根中的表达量极少甚至不表达.大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累.[结论]不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性,TcMCT基因具有明显的组织表达特异性,可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成,推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用. 相似文献
5.
[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达. 相似文献
6.
[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。 相似文献
7.
[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。 相似文献
8.
【目的】对大鲵胸腺素β-4基因进行生物信息学分析和原核表达载体构建,为大鲵胸腺素β-4蛋白生理活性的深入研究奠定基础。【方法】从大鲵皮肤cDNA文库中分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长序列,采用多种生物软件对其进行生物信息学分析,用定量PCR研究胸腺素β-4基因在不同组织的表达情况,并以pET32a为载体构建该基因原核表达载体。【结果】胸腺素β-4基因全长共699bp,其中开放阅读框135bp,5′-UTR 87bp,3′-UTR为474bp,该基因编码45个氨基酸,表达蛋白的理论分子质量为5 141.59u,等电点为5.34;结构分析发现,大鲵胸腺素β-4蛋白氨基酸序列的第7～43位处有"THY"特征模体,没有跨膜螺旋区、细胞膜外在跨膜结构域。氨基酸序列进化关系表明,大鲵与人、大鼠、牛、猩猩、鸡、倭蛙等动物亲缘关系较近,氨基酸同源性高于85%;与猪和爪蟾的亲缘关系次之,氨基酸同源性均为83%;而与虹鳟、大菱鲆、斑马鱼等鱼类的亲缘关系较远,氨基酸同源性低于80%。荧光定量PCR检测结果表明,胸腺素β-4基因在大鲵肺中的相对表达量最高。SDS-PAGE电泳结果表明,构建的大鲵胸腺素β-4原核表达重组菌株pET32a-Tβ4,在37℃条件下,用终浓度1.0mmol/mL IPTG诱导4h后,大鲵胸腺素β-4基因获得了较高的表达。【结论】分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长cDNA序列,该基因氨基酸序列与人等高等动物的同源性最高,能在大鲵肺中及大肠杆菌中获得高效表达。 相似文献
9.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(10)
[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
10.
【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。 相似文献
11.
白羽王鸽泛素(UB)基因的生物信息学分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]对白羽王鸽泛素基因的cDNA序列进行相关分析。[方法]运用相关生物信息学软件对该基因eDNA序列进行分析和预测,编码蛋白的理化性质及二级结构。[结果]生物信息学分析结果表明,白羽王鸽泛素基因编码区长度为1037bp,编码的多肽由76个氨基酸残基组成,相对分子质量为34．368kD,理论等电点为6．94,二级结构中α-螺旋占24．6％,无规则卷曲占43．3％。B延伸链占32．1％。[结论]通过白羽王鸽泛素基因相关生物学信息分析,为进一步研究泛素基因在白羽王鸽机体内的作用奠定了基础。 相似文献
12.
[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5’-Genome Walking和3’-RACE的方法,获得基因的5’-端DNA序列和3’-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5’-端DNA和3’-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1754bp,包括1137bp的开放读码框和617bp的3’-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。 相似文献
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[目的]克隆芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因(MiETR1和MiERS1),并进行生物信息学分析,为研究乙烯受体在芒果成熟和衰老过程中的调控机制提供理论参考.[方法]以芒果为材料,应用RACE技术扩增MiETR1和MiERS1基因的cDNA序列,并应用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行预测分析.[结果]克隆获得的MiETR1基因cDNA序列全长2570 bp,开放阅读框(ORF)2220 bp,编码739个氨基酸;MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp,ORF 1890 bp,编码629个氨基酸;GenBank登录号分别为KY002681和KY002682.MiETR1和MiERS1蛋白均为含跨膜结构的非分泌型疏水蛋白,属于乙烯受体ETR1家族成员,以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导,均含有3个典型的模块,即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域,MiERS1蛋白较MiETR1缺少REC结构域.不同物种ETR1和ERS1蛋白的氨基酸序列具有高度保守性,MiETR1和MiERS1均与甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Cit-rus clementina)的ETR1和ERS1蛋白亲缘关系较近,但二者分别聚在两个不同的分支上,表明两个蛋白存在一定的遗传分化.[结论]乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用. 相似文献
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[目的]运用分子生物学技术克隆棉铃虫蛋白酶体B5亚基新基因,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]以棉铃虫中肠总RNA为模扳,利用快速扩增cDNA末端（RACE）技术克隆棉铃虫蛋白酶体B5亚基新基因的cDNA序列并对所获序列进行分析。[结果]成功克隆了棉铃虫蛋白酶体瞄亚基全长947bp的cDNA序列,命名为Habeta5,包含1个843bp的完整开放读码框（ORF）序列,编码蛋白质为280个氨基酸残基,预测分子量为30．87kD,等电点为6．53。Habeta5蛋白在74～261氨基酸残基位置为蛋白酶体B5亚基的保守区域。Clustal W进行多序列比对发现,Habeta5蛋白质与果蝇等昆虫蛋白酶体B5具有62％以上的同源性,蛋白酶体B5的保守区域高度一致。邻近法NJ分子进化分析也显示,Habeta5蛋白质与其他生物蛋白酶体茚进化上同源。[结论]序列分析比对的结果表明所克隆的基因为棉铃虫蛋白酶体B5亚基基因（GenBank登陆号：FJ358434）。 相似文献
15.
[目的]对萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因进行克隆与分析。[方法]以萝芙木为材料,采用RACE技术,从萝芙木中克隆SGD的全长cDNA,并对其进行表达谱分析和相关生物信息学分析。[结果]萝芙木SGD基因cDNA全长1 856 bp,包含1 608 bp的开放阅读框,编码536个氨基酸,预测分子量为61 kDa,等电点pI为6.16;生物信息学分析显示,RvSGD与蛇根木SGD及长春花SGD的序列相似性分别高达90.1%和70.9%,RvSGD也具有SGD蛋白的3个保守氨基酸催化位点His-161、Glu-207和Glu-419;荧光定量PCR表明,RvSGD在树皮中表达量最高,其次是老叶、根、嫩叶和茎。[结论]RvSGD基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这个基因在TIAs的生物合成中的作用,并为今后调控TIAs的生物合成提供了新的靶点。 相似文献
16.
[目的]研究不同提取方法对盐藻β-胡萝卜素产量的影响,以改进盐藻β-胡萝卜素的提取工艺。[方法]首先比较了丙酮∶甲醇(7∶2)和石油醚2种常用提取试剂对盐藻β-胡萝卜素提取效率的影响;然后以丙酮-甲醇(7∶2)为提取试剂,分别从提取时间、提取温度、固液比3个方面对其提取工艺进行了优化。[结果]相对于石油醚,丙酮∶甲醇(7∶2)对盐藻β-胡萝卜素的提取效率较高。4℃和25℃浸提温度下β-胡萝卜素的得率没有明显差异。分3次提取时,5 m in的浸提时间即可获得较高的提取效率。在1~7 m l的提取剂使用范围内,随着提取剂用量的增加β-胡萝卜素的提取效率有所增加,但增加幅度不是很大。[结论]以丙酮∶甲醇(7∶2)为提取试剂,在25℃下浸提5 m in 3次可以得到较高的提取效率。 相似文献
17.
[目的]研究三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素的代谢调控途径,为通过优化发酵培养条件来提高β-胡萝卜素的产量提供依据和参考。[方法]采用紫外分光光度计测定β-胡萝卜素的含量,优化正负菌孢子接入种子培养基的接种比例,通过对三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素的代谢调控分析,确定最佳补液时间,优化培养温度和接种比例来提高β-胡萝卜素的产量。[结果]最佳孢子接种比例为正菌∶负菌=10∶1,最佳补液时间为52 h,最佳培养温度为27℃,最佳种子液接种比例为8%。[结论]通过对菌体生长代谢的分析优化了培养条件,并将β-胡萝卜素的产量从1.45 g/L提高到2.26 g/L,产量提高了55.9%,取得了较好的效果,为β-胡萝卜素的工业化生产奠定了基础。 相似文献