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1.
[目的]通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持.[方法]以含A型FMDV VP1基因的重组质粒pMD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21 (DE3)中诱导表达融合蛋白.[结果]诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His· Bind和GST· Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应.[结论]经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查. 相似文献
2.
O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达 总被引：8，自引：0，他引：8
以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好． 相似文献
3.
[目的]为预防口蹄疫与幼畜腹泻、生产安全高效的基因工程联合疫苗提供试验依据。[方法]通过基因工程技术,把O型口蹄疫病毒VP1双拷贝21-40(20aa)与141-160(20aa)表位肽基因——2020VP1与产肠毒素大肠杆菌LTB连接到表达载体上,在大肠杆菌中表达出具有抗O型口蹄疫病毒与产肠毒素大肠杆菌双重作用的融合蛋白。[结果]运用基因工程技术构建了融合表达载体r2020-B-2020。转化宿主菌BL21(DE3)RIL后的表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示,重组融合蛋白的分子量约为41 kD,表达量较高。动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的抗FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白可以诱导机体产生有效的抗FMDV细胞及体液免疫反应。融合蛋白能够与霍乱毒素CTB抗体特异结合,免疫雌鼠能够抵抗一定强度的大肠杆菌毒株攻击。[结论]融合蛋白可以同时诱导机体产生较好的抗FMDV及ETEC免疫应答反应,具有开发成为FMDV与ETEC基因工程疫苗的应用价值。 相似文献
4.
猪O型FMDV重组多表位抗原基因的克隆表达及免疫学鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】制备猪O型FMDV广谱多表位疫苗,并筛选最适合的免疫佐剂.【方法】选取O型FMDV 3个毒株VP1蛋白的优势表位,设计并合成重复串联表位基因3FoEN2,并克隆猪IgG重链恒定区基因.利用BamHⅠ,EcoRⅠ等位点将2个基因依次克隆到pProEX-HTb载体,构建重组质粒pE-IgG并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.以IPTG诱导表达得到融合蛋白pE-IgG,经SDS-PAGE电泳分析,Western-blotting鉴定.分别用5种佐剂ISA206、ISA201、IMS1313、603、ISA61乳化融合蛋白配制疫苗免疫BALB/c雌鼠,间接ELISA方法测定抗体水平.【结果】重组蛋白以包涵体形式正确表达,大小为45kU,且能与感染O型FMDV的猪的阳性血清发生特异性免疫反应;ISA201佐剂试验组刺激机体产生的抗体水平最高.【结论】pE-IgG蛋白具有很强的免疫原性,与ISA201佐剂混合制备成的猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗可刺激动物机体产生高水平抗体,是具有良好开发前景的疫苗. 相似文献
5.
[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备及FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其C端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其C端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接ELISA,分别对O、A、C、Asia14型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPRO-CVP1、pPRBO-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33和20kD。Westernblot显示。VPl及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDv阳性血清均未发生交叉反应。且以VP1c端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。 相似文献
6.
C型口蹄疫病毒型特异性抗原的表达与鉴定 总被引：3，自引：1，他引：2
[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备和FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其c端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其c端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接EHSA,分别对0、A、C、Asia1四型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPR0-CVP1、pPR0-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33kD和20kD。Westernblot显示,VP1及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDV阳性血清均未发生交叉反应,且以VP1C端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。 相似文献
7.
O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测 总被引：3，自引：2，他引：1
通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒 VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a( )中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体. 相似文献
8.
AsiaⅠ型口蹄疫病毒江苏分离株VP1基因的克隆与高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】实现牛口蹄疫病毒AsiaⅠ型江苏分离株VP1基因在大肠杆菌中的表达,为VP1蛋白的深入研究奠定基础。【方法】根据GenBank公布的AsiaⅠ型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)核苷酸序列(登录号:AF030244),设计并合成1对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出牛AsiaⅠ型FMDV江苏分离株VP1基因,将其连接入pMD18-T载体,测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-VP1。阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳,利用West-ern-blot分析表达蛋白的抗原性。【结果】牛AisaⅠ型FMDVVP1基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物的相对分子质量约为43 ku,并能被牛AsiaⅠ型FMDV阳性血清识别,有一定的生物学活性,表达量约占菌体蛋白总量的37.7%。【结论】牛AsiaⅠ型FMDVVP1基因表达成功,且表达产物具有一定的生物学活性。 相似文献
9.
O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白,根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段,并将其克隆到p E-SUMO载体中,构建重组质粒SUMOVP0和SUMO-VP1,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示,SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为:20℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h;SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为:37℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明,表达的SUMOVP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,具有很好的反应原性。 相似文献
10.
鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。 相似文献
11.
为了开发出一种可行的羊痘基因疫苗,尝试用羊P32基因与CD58基因建立共表达载体.试验根据GenBank中收录的羊痘病毒(GPV)P32和羊CD58基因组序列,设计了扩增GPV P32基因和CD58基因的特异性引物,运用PCR技术从GPV中扩增出P32基因,从羊的外周血中扩增出CD58基因,并将其分别克隆到pMD18-T载体,测序正确.将P32基因去掉后端疏水区一段与CD58基因先后克隆至载体pBudCE4.1,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定和测序正确,且读码框正确.说明成功获得了真核共表达质粒pBudCE4.1/CD58/P32. 相似文献
12.
对经过卡那霉素抗性筛选所得到的菊花转苏云金芽胞杆菌毒蛋白Bt基因和转雪花莲外源凝集素GNA基因所得的抗性植株 ,利用改良SDS法提取菊花DNA ,然后利用NPTII引物对 6个菊花品种的抗性植株所提DNA进行PCR扩增 ,发现了符合NPTII基因片段大小的亮带 ,初步证实获得了转Bt基因和转GNA基因的菊花植株。 相似文献
13.
Anti-trxs和Bar基因共转化小麦后代植株的遗传及表型分析 总被引：2，自引：1，他引：2
经对基因枪转化小麦品种皖麦48获得的7株再生苗的PCR、PCR-Southern杂交和除草剂涂抹叶片检测,得到了4株转基因植株,证实了硫氧还蛋白反义基因(Anti-trxs)和抗除草剂Bar基因已经整合到小麦基因组中且能够正常表达。经对T1、T2植株分析表明:Anti-trxs、Bar基因能够稳定的遗传给后代,且普遍呈3∶1的分离,其遗传符合单基因控制的孟德尔遗传规律,部分株系表现1∶1的不正常分离(阳性个体较预期的少),推测这是由于雌或雄配子之一方丢失或外源基因的结构、排列等方面发生了变化的结果。转基因植株的农艺性状与对照相比,T0代有较大变异,但在T2代已得到了回复。 相似文献
14.
通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体. 相似文献
15.
为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXAl中扩增出0.95 kb α毒素基因,将其连接到经Nco I单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kb β1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kb α-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实.构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导荆诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基PH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol.L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株. 相似文献
16.
植物抗病基因类似序列的研究进展及应用策略 总被引：5，自引：0，他引：5
植物抗病基因克隆对抗病育种和抗病机制的研究具有重要意义。对已克隆出的基因研究表明,大多数的抗病基因都具有高度保守的结构域(如NBS,LRR,LZ,STK和TIR等)。根据这些保守区域设计核苷酸引物,通过PCR技术已经获得很多的RGA,然后以此为探针筛选DNA或cDNA文库,最终可获得抗病基因的候选克隆,这就是新近发展起来的同源序列克隆技术。文章简述了对抗病基因的结构特征,同源序列克隆技术及其应用策略。 相似文献
17.
芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%. 相似文献
18.
前期研究发现,HOPX基因在鸡脂肪组织高表达,为了解该基因在脂肪发育过程中的作用,采用RT-PCR方法,扩增和克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并进行序列分析;采用real-time RT-PCR和半定量RT-PCR的方法,开展了HOPX基因的组织表达谱分析、HOPX基因在东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系脂肪组织发育过程中的表达差异分析以及鸡脂肪细胞分化过程中的表达分析。研究结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区为222 bp,编码73个氨基酸。HOPX基因在鸡的多种组织中表达,其中,在脂肪组织中的表达量最高;在高、低脂系肉鸡的脂肪组织生长发育过程中,HOPX基因的表达均随年龄增长而上升,且高脂系鸡HOPX基因的表达量高于低脂系;在鸡脂肪细胞分化过程中,HOPX基因的表达呈上升趋势。HOPX基因的表达分析结果提示,该基因在鸡脂肪组织生长发育过程中发挥作用。 相似文献
19.
大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。 相似文献
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为研究柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)ptp-2基因特性,根据ApNPV PstⅠ-C片段核酸序列,设计引物克隆了ApNPV ptp-2基因;将ptp-2基因亚克隆至原核表达载体pQE-30,构建重组质粒pQE-ptp-2,并在大肠杆菌M15中进行诱导表达,表达量达菌体总蛋白的38.7%,经His标签杂交鉴定证明表达产物为His融合蛋白.以原核表达的His-PTP-2蛋白作为抗原,制作兔多克隆抗血清,Western blot分析表明:PTP-2蛋白不参与ApNPV包涵体的结构组成. 相似文献