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[目的]建立能同时检测甘蔗花叶病(sugarcane mosaic virus,SCMV)和宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)的多重PCR检测方法.[方法]以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR 引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种(Leifsonia xyli subsp.Xyli,Lxx) 的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单-PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法.[结果]此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV(400 bp)和RSD(265 bp)2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%, RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%.[结论]应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原. 相似文献
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[目的]在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术.[方法]以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBuffer Ⅱ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定.[结果]优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA( 15.9 pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释10倍的Lxx基因组DNA( 159 pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定.对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7%,而常规的PCR检测RSD感染率为0.[结论]优化的PCR体系为:2xGC Buffer Ⅱ12.5 μL,Ex Taq DNA酶(5 U/μL)0.2 μL;dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL;Lxx1(10 μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μLcPCR反应程序为:95℃预变性10 min,94℃ 15s,57℃ 15 s,72℃ 30 s,40个循环;72℃延伸10 min.优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测. 相似文献
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[目的]在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx 16S～23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术.[方法]以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBuffer Ⅱ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定.[结果]优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx 16S～23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA( 15.9 pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释10倍的Lxx基因组DNA( 159 pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定.对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7％,而常规的PCR检测RSD感染率为0.[结论]优化的PCR体系为:2xGC Buffer Ⅱ12.5 μL,Ex Taq DNA酶(5 U/μL)0.2 μL;dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL;Lxx1(10 μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μLcPCR反应程序为:95℃预变性10 min,94℃ 15s,57℃ 15 s,72℃ 30 s,40个循环;72℃延伸10 min.优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测. 相似文献
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[目的]验证安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白(COWP)的免疫原性,为建立安氏隐孢子虫病免疫学诊断方法奠定基础.[方法]根据GenBank已公布的安氏隐孢子虫COWP同源基因序列(DQ060431)设计引物,克隆COWP基因并构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用蛋白印迹法检测其免疫原性.[结果]扩增获得的COWP基因片段为549bp,其序列与GenBank已公布CO WP同源基因序列(DQ060431)的同源性达100％,将其插入pET-32a载体可构建pET-32a-COWP表达载体.重组菌在30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导5h后,其表达形式以可溶性表达为主;NTA-Ni亲和层析柱层析时用200 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,即能得到纯化的重组蛋白,重组蛋白分子量约40 kDa.以抗His标签鼠单克隆抗体或鼠抗安氏隐孢子虫高免血清为一抗进行Western blotting检测,均能获得预期的目的条带.[结论]重组COWP蛋白具有良好的免疫原性,可作为安氏隐孢子虫病免疫学诊断的候选抗原. 相似文献
5.
甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)病原物为革兰氏阳性菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)。采用透射电镜和扫描电镜观察Lxx离体培养物形态和感病蔗茎维管超微结构,并用光合仪测定感病甘蔗+1叶光合作用相关指标。结果表明:改良的MSC培养基适于Lxx生长,培养的菌体形态多样,有隔膜和简体;菌体内细胞质分布不均,有电子透明物、电子稠密物及隔膜;RSD病原菌寄居在木质部导管的纹孔和导管壁上,其内粘附许多颗粒状物质;感染RSD蔗株的光合速率、气孔导度、胞间CO2和蒸腾速率均低于健康蔗株,RSD可降低甘蔗的光合作用。 相似文献
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[目的]获得重组表达质粒pGEX-6P-N在大肠杆菌BL21中高效表达,分析表达蛋白的免疫学活性及纯化后蛋白的浓度.[方法]通过优化诱导剂终浓度和诱导时间来实现融合蛋白的高效表达,使用BCA法测定蛋白浓度,利用Western blotting分析融合蛋白的免疫学活性.[结果]融合蛋白在37℃条件下,经终浓度为1.2 mmol/L的IPPG诱导表达4.5 h后获得了较高的表达水平.纯化后的融合蛋白经BCA法测定蛋白浓度达到0.587 mg/mL.Western blotting试验表明,GST-N蛋白能与抗PRRSV阳性血清发生特异性反应.[结论]为建立N特异性抗体的间接ELISA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础,为新疆PRRS的防控提供了理论支持. 相似文献
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为了解不同甘蔗品种的甘蔗宿根矮化病(RSD)感病情况,采用PCR检测方法,对13个甘蔗品种进行RSD感病率检测.结果显示,在所检测的13个甘蔗品种中,不同品种感病率有所差异,其中所检测的2个CP系列感病率最低.同时,利用MSC培养基从感染RSD的甘蔗蔗汁中分离培养到一种生长缓慢、菌落颜色为乳白色的杆状细菌.根据菌落形态、显微镜观察,以及特异引物和16S rDNA扩增多种方法鉴定,最终确认所分离到的杆状细菌即为甘蔗宿根矮化病病原菌(Lei sonia xyli subsp.xyli). 相似文献
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根据甘蔗宿根矮化病(RatoonStuntingDisease,RSD)病原细菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli,Lxx)16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计的一对特异性引物,建立了甘蔗宿根矮化病PCR检测方法;同时对PCR扩增的目的片段核苷酸序列进行测定与分析。结果表明广东湛江蔗区RSD病菌16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国路易斯安娜州RSD株系基因组相应区段核苷酸同一率接近100%,病菌高度的同源。而与近缘的木质部赖氏杆菌狗牙根变种(Leifsoniaxylisubsp.Cynodontis,Lxc)和形态上相近的马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis)基因组相应区段核苷酸同一率较低,存在明显的分化。 相似文献
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[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体. 相似文献
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[目的]通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持.[方法]以含A型FMDV VP1基因的重组质粒pMD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21 (DE3)中诱导表达融合蛋白.[结果]诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His· Bind和GST· Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应.[结论]经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查. 相似文献
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甘蔗花叶病和宿根矮化病多重PCR检测方法的建立 总被引：6，自引：0，他引：6
【目的】建立能同时检测甘蔗花叶病（sugarcane mosaic virus,SCMV）和宿根矮化病（ratoon stunting disease,RSD）的多重PCR检测方法。【方法】以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种（Leifsonia xyli subsp. Xyli,Lxx）的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单一PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法。【结果】此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV（400 bp）和RSD（265 bp）2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%,RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%。【结论】应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。 相似文献
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介绍了入侵检测系统和数据挖掘的有关概念，比较了误用检测与异常检测方法的优缺点，探讨了数据挖掘技术在入侵检测系统中的应用，提出系统的体系结构，并分析了系统的工作流程及其特点。 相似文献
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毒鼠强是剧毒鼠药,其毒性大约是氟乙酰胺的3~30倍,氰化钾的100倍。毒鼠强的滥用严重威胁着人们的生命和健康,其检测对确定人或动物的中毒原因及中毒抢救等具有十分重要的意义。文章对疑为毒鼠强中毒时样品的采集和处理以及毒鼠强的检测方法进行了阐述。 相似文献
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浅谈计算机网络入侵检测 总被引：1，自引：0，他引：1
本文介绍了计算机网络入侵检测的概念和入侵检测的步骤,重点分析了入侵检测的分类、入侵检测技术及存在的主要问题,最后介绍了入侵检测的发展方向. 相似文献