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相似文献
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1.
TaqMan荧光定量RT-PCR检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒   总被引：2，自引：0，他引：2  
根据GenBank登录的高致病性PRRSV Nsp2基因序列利用Primer Express 3.0软件设计合成了引物和探针;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan 荧光定量RT-PCR检测方法.同时用建立的检测方法对以定量的10倍系列稀释质粒pMD- Nsp2为标准品进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比.结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达3.15 拷贝,比常规RT-PCR灵敏度高100倍.用该方法对3份不同的标准品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前高致病性PRRSV的诊断需要.  相似文献   

2.
为建立一种特异、灵敏、量化、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,设计1对PEDV N基因的特异性引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量RT-PCR的检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测。结果显示,所建立的实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999;不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生交叉反应,具有较强的特异性;灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍;重复性试验的变异系数均小于5%,重复性良好。对43份临床样品进行检测,结果比普通PCR多检出2份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法在特异性、灵敏度和重复性方面都很好,可用于临床PEDV检测。  相似文献   

3.
本研究将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因部分片段克隆并连接到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒,以此为标准模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对20份临床疑似病料进行检测,发现14份为荧光定量RT-PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出10份。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。  相似文献   

4.
为建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的SVCV N蛋白基因的保守性序列设计并合成特异性引物,建立了该病毒的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.99,在102拷贝/μL~109拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法对传染性脾肾坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、传染性皮下及组织坏死病毒和白斑综合征病毒其他水生动物病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对SVCV检测下限为100.76 TCID50/m L,比常规PCR灵敏100倍;批内和批间的变异系数均小于7.6%,重复性好。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,对SVCV的快速检测及定量检测具有重要意义。  相似文献   

5.
荧光定量RT-PCR检测猪日本脑炎病毒   总被引：1，自引：0，他引：1  
通过RT-PCR方法克隆了日本脑炎病毒(JEV)N基因片段序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,同时根据GenBank中的靶序列设计了荧光定量R-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了JEV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108和1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为17.33、20.52和23.90,变异系数分别为0.54%、0.74%和0.53%,均小于5%.对阳性组织病料的检测表明该方法的灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nested-PCR,nPCR)具有相近的灵敏度.  相似文献   

6.
本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。  相似文献   

7.
根据猪札幌病毒(Porcine Sapovirus,SaV)的VP1保守基因序列设计引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并与常规RT-PCR检测方法进行了比较。结果表明,荧光定量RT-PCR方法的检测灵敏度可达16.1拷贝.μL-1,而常规RT-PCR方法的灵敏度为1.61×103拷贝.μL-1。对216份粪样的检测结果进一步表明该法(检出4份)比常规RT-PCR方法(检出3份)的灵敏度高。系统进化分析表明,该4株病毒均为GⅢ型,与SaV上海分离株(FJ387164)同源性为100%。该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于猪SaV感染的流行病学调查和临床诊断。  相似文献   

8.
牛病毒性腹泻病毒不同检测方法的比较研究   总被引：2，自引：0，他引：2  
采用Idexx公司抗原捕获ELISA试剂盒对新疆部分地区160份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒抗原检测,结果有6份样品为阳性,对该6份血清用BVDV阴性血清进行了系列稀释后,分别用抗原捕获ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR进行检测,发现RT-PCR方法比ELISA检测灵敏度高10-100倍,荧光RT-PCR比RT-PCR灵敏度高约10-100倍。  相似文献   

9.
根据犬瘟热病毒的核衣壳蛋白(N)基因保守序列,设计特异性引物,建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法敏感性比普通RT-PCR高出100倍,重复性良好,变异系数在1.01%以下,对犬的常见病原核酸提取物检测均为阴性,证明特异性良好。对32份临床样本进行检测,27份为阳性,高于普通RT-PCR方法。试验结果表明该方法可用于犬瘟热感染情况的检测。  相似文献   

10.
猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立   总被引：4，自引：1，他引：3  
通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒(CSFV) 5′端非编码区(UTR)的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为 109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为19.73、22.95和26.24;变异系数分别为0.61%、1.77%和1.18%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.  相似文献   

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