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1.
从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测,旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品,并扩增出PED病毒M、ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明,与CV777疫苗株对比,样品渭南(WN)株PEDV M基因高度保守,同源性为98.2%;ORF3基因存在11处碱基突变,同源性为98.2%;S基因突变较大,存在4个插入区域,分别是164~166、177~179、181~186和416~418nt,内分核心中和表位区(COE,499~638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示,WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近;ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近,而与CV777疫苗株亲缘关系较远;S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远,与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明,WN株与CV777疫苗株相比,有明显的遗传变异倾向,可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降,PED疫情大规模流行。 相似文献
2.
【目的】分析目前陕西省猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的E0、E2全基因分子特征,为猪瘟防控提供参考。【方法】根据CSFV Shimen株及HCLV株全基因序列,设计并合成了4对引物,采用RT-PCR方法,从采自陕西不同地区的猪瘟病料中扩增E0、E2全基因并进行序列测定分析。【结果】从采集的病料中成功扩增了5株猪瘟流行毒株的E0、E2全基因,这5株流行毒株E0基因核苷酸同源性在94.4％～99.8％,与参考毒株ALD、Alfort187、Brescia、CAP、Glentorf、GPE、GXWZ02、HCLV、Paderborn、Rimes和Shimen的核苷酸同源性在80.4％～96.3％,氨基酸同源性在86.5％～99.3％。5株流行毒株E2基因核苷酸同源性在91.1％～98.0％,与参考毒株的核苷酸同源性在77.7％～94.6％,氨基酸同源性在85.2％～95.9％。5株流行毒株E0 Rnase活性区域氨基酸基序位点没有变异,但导致流行毒株发生免疫逃逸的E2蛋白关键位点中有3个发生了变异。【结论】测定的陕西省猪瘟流行毒株E0、E2基因序列变异明显,其中E2蛋白关键位点变异较大。 相似文献
3.
《福建农业学报》2015,(6)
为了解2012-2014年福建省流行PEDV毒株E和M基因的变异情况,对19株PEDV的E基因和18株PEDV的M基因进行克隆和序列分析。结果表明:与CV777标准毒株相比较,福建流行PEDV毒株的E和M基因存在编码的部分氨基酸变异。19株PEDV E基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.4%~100.0%和97.0%~99.6%。18株PEDV M基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.2%~99.6%和97.5%~98.4%。核苷酸遗传进化树表明福建流行PEDV毒株的E基因与CV777亲缘关系较近,而M基因与2008年泰国流行的KU05CB08毒株亲缘关系较近,是个新的基因型,可能源于泰国。 相似文献
4.
分析闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的遗传进化特征,收集闽西地区猪流性腹泻病例组织样品8份,用逆转录PCR(RT-PCR)扩增N基因,连接至pMD-18T载体进行测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果显示,8株闽西流行毒株之间N基因核苷酸的同源性为9.8%～100.0%,推导的氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%,而闽西毒株与早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性较远。氨基酸序列分析表明,闽西毒株氨基酸序列存在15处突变,与2010年后中国流行毒株变异位点相同。提示闽西地区毒株为目前国内流行毒株,与疫苗毒株亲缘关系较远,可能导致机体针对疫苗毒株产生的抗体不能够有效抵抗变异毒株,不能给猪群提供很好的免疫保护,因此需要基于变异毒株研究出有针对性的疫苗来预防PEDV。 相似文献
5.
[目的]分析江苏省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况.[方法]采用RT-PCR方法对2013年3月至2014年12月从江苏省9个不同地区采集的174份病料进行病原学检测和流行病学调查,并对来自不同地区9株病毒的部分M基因进行克隆、测序和分析.[结果]江苏省PEDV的个体阳性率为17.92％,猪场阳性率为61.54％;与经典病毒株CV777相比,9株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列都有突变.同源性分析表明,江苏省内PEDV毒株的核苷酸同源性为97.8％ ～ 100.0％,但与欧洲毒株的同源性较低;遗传进化分析表明,江苏省PEDV流行株和参考株可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,7株江苏省毒株和一些其他国内毒株、泰国毒株、韩国毒株以及美国毒株属于Ⅰ群,而另外2株江苏株与2株泰国株构成了Ⅲ群,而现用疫苗株CV777则属于Ⅱ群.[结论]江苏省内PEDV有一定程度的进化和变异,并且需要选择更有效的疫苗株来控制PEDV的流行. 相似文献
6.
参考GenBank中PEDV经典CV777毒株基因组序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法对临床采集的疑似PEDV样品进行S基因扩增、克隆和测序,拼接获得30条完整S基因序列,并进行遗传进化及同源性分析。结果显示,获得的30条PEDV S基因与25个参考株S基因的核苷酸相似性介于93.6%～99.8%;且各流行毒株与经典毒株比较,具有多处的点突变、插入和缺失。与其他参考株相比,S1区存在157个氨基酸突变位点,占总数的65.7%（157/239）,暗示PEDV的 S1区域比S2区域易发生变异;表明目前中国PEDV流行株已经发生了变异,在一定程度揭示了免疫猪群仍然发病的原因。 相似文献
7.
为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,对5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果表明,5株PEDV安徽流行毒株M基因的全长均为681 bp,编码226个氨基酸,核苷酸同源性为99.1%～99.9%,其与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性为96.9%～100%。进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株的亲缘关系较近。 相似文献
8.
为调查近年来河南省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,从2015—2017年河南部分地区猪场患腹泻仔猪的小肠组织及内容物中克隆了15株PEDV ORF3基因,并对其进行了序列测定及分析。结果显示,15株PEDV河南株 ORF3 基因序列长度均为675 bp。15株PEDV分离株之间核苷酸同源性为94.4％～99.9％,与经典毒株CV777、弱毒株attenuated DR13核苷酸同源性分别为95.7％～97.0％和96.6％～98.1％。遗传进化分析显示,PEDV分为两大群,3株分离株属于G1群,单独成一个小的分支。其余12株分离株与往年河南流行株、大部分国内分离株、韩国、日本、美国及法国毒株位于G2群,亲缘关系较近,而与经典毒株CV777亲缘关系较远。表明河南省PEDV有变异和进化趋势,为河南省PED的防控和疫苗的研制提供技术支持。 相似文献
9.
根据NCBI上传的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)[GenBank:JN547228(CH/S)],设计引物对阳性病料进行鉴定并回收,与pMD18-T构建重组载体并测序。对猪流行性腹泻病毒的基因多样性及序列保守性进行分析,一是以经典毒株为主,包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等为代表的G1基因型,另一种是以近几年分离的毒株为主,包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等为代表的G2基因型。基因同源性分析比较结果表明,这4株PEDV之间的序列同源性为97.6%～100.0%,与经典株CV777的同源性为92.7%～92.8%。同源分析显示,PEDV不同毒株间的基因同源性仍高度相似,但PEDV流行毒株已呈现进化分支的趋势。 相似文献
10.
【目的】对猪流行性腹泻病毒安徽毒株AH-2018-HF1进行全基因组测序,了解该毒株的分子生物学特征和遗传进化情况,为PEDV的进化和变异研究提供参考。【方法】从PEDV阳性病料（肠道组织）中提取RNA,反转录获得cDNA。将PEDV基因分为9段,设计相应的引物,采用分段重叠法对PEDV基因组进行分段扩增,扩增产物经克隆测序后,采用DNAstar软件拼接,获得全基因组,将此全基因序列与GenBank上公布的国内外25株PEDV毒株进行比对和分析。【结果】PCR扩增获得了4 036,3 724,2 874,3 600,3 950,4 187,3 576,2 953和1 138 bp的9条目标片段,测序拼接后获得了27 937 bp的PEDV全长基因组。AH-2018-HF1株与经典株CV777（疫苗株）全基因序列同源性为97.7%,S基因同源性为96.7%,ORF3基因同源性为90.8%。全基因组序列对比发现,AH-2018-HF1株与SD-M株同源性最高,为99.9%;与PEDV/MEX/QRO/02/2017同源性最低,为96%。S基因序列分析结果显示,AH-2018-HF1株在2 319-2 320位缺失3 bp碱基（GTT）;与CV777、LZC株相比,AH-2018-HF1株在459-460位缺失3 bp碱基（ATA）;和国内外变异毒株相比,AH-2018-HF1株在174-175位缺失12 bp 碱基(CAGGGTGTCAAT),在461-462位插入6 bp碱基（TGGAAA）。ORF3基因序列分析结果显示,AH-2018-HF1株在245-296位有49个碱基缺失。全基因组系统进化树分析表明,AH-2018-HF1与SD-M亲缘性最近,与CV777亲缘性较近,与国内外变异毒株的亲缘关系较远;S基因系统进化结果与全基因组系统进化结果相似;ORF3基因系统进化分析结果与全基因组系统进化结果不同。【结论】AH-2018-HF1仍属于经典毒株,但存在一定的变异,表明PEDV处于不断的进化中。 相似文献
11.
【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。 相似文献
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FLOWERING LOCUS T(FT)基因是植物开花调控途径的整合基因,整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号,在植物花发育中发挥着重要作用。从墨兰品种‘企剑黑墨’中克隆了新的FT同源基因,并对其各组织部位的表达特性和生物学功能进行了分析。结果表明,墨兰FT基因c DNA全长序列为618bp,其中开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、水稻中FT基因的氨基酸序列有较高的同源性。墨兰FT同源基因在‘企剑黑墨’各器官中均有表达,营养生长期FT基因在腋芽中的表达量最高,生殖生长期FT基因在腋芽,花梗,花蕾等器官中的表达量较高,在根和叶中的表达量最低。在拟南芥中超表达墨兰FT同源基因,能显著促进拟南芥开花。 相似文献
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【目的】明确陕西省主要水稻种质资源中香味基因的存在状况,为香型水稻育种提供依据。【方法】利用针对香味基因fgr开发的四引物扩增受阻突变体系PCR技术,对陕西省164份水稻种质资源的香味基因fgr进行检测。【结果】在164份供试水稻材料中,127份为非香材料,2份为香型纯合体,35份为杂合体。【结论】本试验检测结果真实可靠,所用四引物扩增变阻突变体系PCR可以作为香型水稻检测认定的有效方法;陕西省水稻种质资源中香味基因占有一定比例。 相似文献
14.
为分析梅花鹿KGF基因的生物学特性及其在鹿茸生长不同阶段顶端茸皮组织的表达差异,以雄性梅花鹿茸皮组织为试验材料克隆梅花鹿KGF基因,并采用荧光定量PCR技术对KGF基因在梅花鹿鹿茸顶端不同生长阶段的茸皮组织中的表达量进行差异分析。结果表明:1)成功克隆获得梅花鹿KGF基因的完整编码区,全长为585 bp,共编码194个氨基酸;KGF基因编码的蛋白质是具有跨膜结构的不稳定的亲水蛋白,其相对分子质量为22 489.17,理论等电点pI为9.35;二级结构以无规则卷曲为主;2)通过Blastp功能比对显示梅花鹿KGF基因与马鹿、白尾鹿、牛、野牛、山羊的相似性均在99%以上;3)荧光定量PCR结果显示,KGF基因的表达量在梅花鹿鹿茸前期与中期、前期与后期的顶端茸皮组织中差异显著(P<0.05),其在中期的表达量是前期的(2.158 5±0.014 1)倍,后期的表达量是前期的(1.728 5±0.225 3)倍;其表达量在中期与后期差异不显著(P>0.05)。综上,本研究发现梅花鹿KGF基因在进化中的保守性较高,对鹿茸的生长发育与组织修复有重要作用,其在不同时期茸皮组织中的相对表达量存在差异。本研究为进一步探索鹿茸生长的分子机理奠定基础,为哺乳动物的组织创伤修复提供参考。 相似文献
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对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。 相似文献
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【目的】研究草甘膦胁迫下甘薯生理指标以及EPSPS和AKR 2个基因相对表达水平的变化,探讨甘薯耐草甘膦的分子机制。【方法】选取对草甘膦敏感性不同的2个甘薯品种N3589(草甘膦敏感型品种)和鄂薯11(草甘膦抗性品种)为试验材料,以喷施清水为对照,研究喷施草甘膦后甘薯莽草酸和脯氨酸含量及根系活力的变化,以及EPSPS和AKR基因的表达情况。【结果】与喷施清水对照相比,喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589叶片的莽草酸含量显著升高,草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的莽草酸含量升高不显著;2个品种甘薯块根和叶片的脯氨酸含量均显著升高;植株的根系活力均显著降低。q-PCR结果显示,在喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589的EPSPS基因显著下调,AKR基因先上调表达后下调表达;而草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的EPSPS基因显著上调,AKR基因先下调表达后上调表达。【结论】甘薯耐草甘膦主要是因为喷施草甘膦之后,EPSPS基因迅速上调表达,从而减少体内莽草酸累积对植株造成的伤害;与此同时,喷施草甘膦后AKR基因迅速上调表达,参与了甘薯体内草甘膦的代谢。 相似文献
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【目的】建立一种特异、灵敏的牛源幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)检测方法,为家畜感染幽门螺杆菌的流行病学调查鉴定提供支持。【方法】分别选取Hp的16SrRNA、UreA、glmM为靶基因设计特异性引物,以H.pylori动物模型适应菌株SS1株为标准菌株建立PCR检测方法,并进行PCR条件优化,运用所建立的最优PCR方法检测临床奶牛乳样和粪样中Hp的分布情况。【结果】PCR特异性试验结果显示,仅Hp SS1株能扩增出特异性条带,而对照菌株金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌及蜡样芽孢杆菌均无扩增条带。PCR灵敏度试验结果显示,16SrRNA、UreA、glmM基因在乳样中的最低检出浓度分别为101,103和103CFU/mL,在粪样中的最低检出浓度分别为101,104和104 CFU/mL。应用该PCR方法对采集自规模化养殖场及散养的共计41头奶牛的乳样和粪样进行检测,成功检出Hp DNA,靶基因16SrRNA、UreA和glmM序列与NCBI上所发表的J166和ATCC43504菌株序列的同源性均达98%以上。【结论】成功建立了特异、灵敏的牛源Hp的PCR检测方法,可以应用于临床奶牛乳样和粪样中Hp的检测。 相似文献
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【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%. 相似文献
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【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。 相似文献
20.
【目的】克隆细粒棘球蚴(Eg)内质网膜蛋白4(Reticulon-4,RTN4)抗原基因,对其序列进行生物信息学分析。【方法】采集感染Eg的绵羊肝脏和肺脏,提取Eg头节总RNA为模板,对RTN4基因进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】Eg RTN4cDNA全长654bp,编码217个氨基酸,蛋白质分子质量为25.3ku,等电点为8.83。编码氨基酸序列中含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。经生物信息学软件预测,RTN4蛋白的抗原表位区主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位区域;含有2个高度疏水区,2个跨膜区,膜外区分别位于第1-47位和第171-217位。【结论】成功克隆了Eg RTN4基因,预测了其编码蛋白抗原的结构和表位。 相似文献