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1.
《畜牧兽医学报》2016,(6)
本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%。通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除。 相似文献
2.
《中国家禽》2017,(7)
试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Em-bryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据。克隆CPED1基因全长;构建cas9/g RNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳性细胞,采用T7E1酶切法选择活性最佳的敲除载体并分析其敲除效率;同时,对DF-1中的脱靶效率进行检测。结果成功克隆鸡CPED1基因,并构建3个cas9/g RNA载体;T7E1酶切结果表明cas9/g RNA1载体在DF-1阳性细胞中的敲除活性(37%)最佳,该载体也可定点敲除ESCs中的CPED1基因,敲除活性为25%,且在DF-1细胞中未发生脱靶。表明CRISPR/Cas9可有效介导鸡CPED1基因在DF-1和ESCs上敲除。 相似文献
3.
为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0%,并在鸡DF-1细胞基因组上实现了AMHR2基因的精确编辑。 相似文献
4.
【目的】 探究敲除Toll样受体7（Toll-like receptor 7，TLR7）基因对水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）复制的影响。【方法】 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞（porcine renal epithelial cells，PK15）系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞，收获慢病毒并感染PK15细胞，经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7-/-多克隆细胞，并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功，分别利用光学显微镜和细胞毒性检测（cell counting kit 8，CCK-8）观察并检测PK15、PK15-TLR7-/-细胞的形态与活力；利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7-/-细胞后病毒增殖情况；利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7-/-细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况；利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7-/-细胞后子代病毒产生情况。【结果】 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑，其中sgRNA2的基因编辑效率最高，但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力；当感染VSV-GFP后，通过荧光显微镜观察发现，荧光强度随着时间逐次增加，且PK15-TLR7-/-细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示，相同时间点的PK15-TLR7-/-细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞（P<0.05；P<0.01）；实时荧光定量PCR结果表明，感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加，且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7-/-细胞（P<0.05；P<0.01）；Western blotting结果表明，PK15与PK15-TLR7-/-细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达，表达量随时间逐渐增多，且在PK15-TLR7-/-细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高；感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放，此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7-/-细胞（P>0.05），但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7-/-细胞（P<0.05；P<0.01）。【结论】 TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制，初步验证了TLR7在天然免疫中的作用，为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路。 相似文献
5.
试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体（FXR）基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D595 nm值极显著低于野生型HeLa细胞孔（P<0.01）,说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。 相似文献
6.
《中国家禽》2016,(7)
随着基因编辑技术的飞速发展,CRISPR/Cas9技术逐渐成为主流。为了验证CRISPR/Cas9系统在鸡基因组上的切割效率,在鸡肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因第1、第2外显子上各自筛选了5个Cas9靶点,构建p X330-sg RNA表达载体;将GFP质粒电转入DF-1细胞,通过检测表达GFP细胞的比例来优化电转程序;将载体用优化后的电转程序电转入DF-1细胞,培养72 h;最后收集细胞提取基因组,通过T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)酶切试验,选出具有Cas9切割效率的靶点片段,将该片段连入p MD19-T载体,测序并分析结果。结果表明CRISPR/Cas9系统可以成功对DF-1细胞基因组进行切割并引入突变,其中1号外显子上4号靶点的突变率为64.3%,2号外显子上2号靶点的突变率为23.3%。研究表明CRISPR/Cas9系统在DF-1细胞中可以有效切割基因组,为CRISPR/Cas9技术应用于鸡的基因组编辑提供科学依据。 相似文献
7.
旨在获得猪CCAR1基因的完整CDS序列，研究其亚细胞定位和表达特性，探究其对细胞增殖的影响和作用机制。本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术分段扩增猪CCAR1基因的CDS区，通过测序和序列拼接获得完整CDS区；采用细胞免疫荧光技术检测CCAR1在PK15细胞中的定位；采用qRT-PCR技术检测猪CCAR1基因的时空表达规律；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PK15细胞的CCAR1基因，通过qRT-PCR、Western blot以及CCK8（cell counting kit 8）技术检测CCAR1基因敲除对细胞增殖能力及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果表明，猪CCAR1基因的完整CDS区长3 459 bp（MH301308.1），在PK15细胞的细胞质和细胞核中均有表达。大白猪和马身猪不同组织CCAR1的表达谱基本相似，在所检测的组织中均有表达，均表现为在肾和小肠中表达量最高，在脾、肝、小脑和肌肉中呈中度表达，在心和皮下脂肪中低表达；CCAR1基因在大白猪和马身猪初生、3月龄和6月龄3个年龄阶段的两种骨骼肌中也均有表达。CRISPR/Cas9基因编辑系统能有效降低CCAR1的表达，在转染48 h后，相比于对照组，试验组都对细胞增殖产生极显著抑制（P<0.01）；CCAR1基因敲除后，细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降（P<0.05），Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降（P<0.05），Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异。CCAR1基因在猪不同组织和不同发育阶段均有表达，可能通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖，在猪的生长发育过程中起重要作用。 相似文献
8.
本研究旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法及细胞水平上的PCR扩增测序筛选出靶向食蟹猴NTCP基因具有高敲除活性的gRNA。首先通过比对食蟹猴与人类NTCP氨基酸序列,选择差异位点,即第84-87位和第157-165位氨基酸作为基因靶点序列区;利用gRNA软件设计针对上述基因靶点序列的gRNA,每个靶点设计3~4条候选gRNA序列;然后利用gRNA体外检测试剂盒,筛选出靶向NTCP基因的体外敲除活性较高的两条gRNA序列：gRNA1.2和gRNA2.1。将gRNA1.2和gRNA2.1分别插入pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP载体中,转染食蟹猴原代肝细胞。提取转染后细胞基因组DNA,通过PCR扩增NTCP基因并将其克隆到T载体中进行测序分析。结果表明,gRNA1.2和gRNA2.1均可使NTCP基因产生移码突变,但gRNA2.1比gRNA1.2具有更高的敲除活性。本研究为下一步编辑食蟹猴NTCP基因及研究其在乙型肝炎病毒（HBV）感染中的功能奠定了基础。 相似文献
9.
研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞（PEF）中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降，从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs，并以单链寡核苷酸的形式合成，退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接，构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体，用Sanger软件进行测序；将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞，48 h后收集细胞，用流式细胞术分选检测细胞转染效率，用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率；用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后，靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明，针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中；流式细胞术分选结果显示，转染效率约70%；半定量PCR结果表明，与对照组相比，3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达（P<0.01），其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%；Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组；实时荧光定量PCR结果表明，Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组（P<0.05），且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高（70%）。半定量PCR结果显示，转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达，表达量为对照组的25%~30%（P<0.01）。免疫荧光检测结果表明，敲降SUV39H1和SUV39H2基因后，组蛋白H3K9me3水平显著降低（P<0.05）。因此，本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2，并下调其催化的H3K9me3水平。 相似文献
10.
旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。 相似文献
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在实验室前期利用猪肾细胞（PK-15）CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-GeCKO）筛选到猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶（ALG5）的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA（gRNA）的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮（NPTr）细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID50和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示：获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系（ΔALG5）,ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。 相似文献
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试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因敲除的猪回肠上皮（immortal pig intestinal-2I,IPI-2I）细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体（pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5）共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞（片段敲除效率为15.5%）,其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。 相似文献
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本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。 相似文献
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This study was aimed to screen gRNA of efficient knockout activity targeting Macaca fascicularis NTCP gene by the CRISPR/Cas9 enzyme digestion method and PCR amplification methods in vitro.Comparing NTCP gene sequences between Macaca fascicularis and human,the sequences of NTCP gene coding amino acid 84 to 87 and 157 to 165 were chosen as gene knockout targets.3 to 4 candidate gRNA sequences were designed in two target sequence regions through gRNA software.By screening cleavage activity targeting NTCP gene in vitro,gRNA1.2 and gRNA2.1 were selected and inserted into pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP plasmid,respectively.The genome DNA was extracted from primary hepatocytes after gRNA1.2 and gRNA2.1 being transferred,respectively.Then NTCP sequences were amplified by PCR and sequenced by being cloned into T vector.The results indicated that compared to gRNA1.2,gRNA2.1 had much higher activity to make a frame-shift mutation in NTCP gene.This study laid a theoretical foundation for further editing NTCP gene and its biological function in Macaca fascicularis. 相似文献
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Mutation in myostatin (MSTN) gene resulted in double muscle effect,generating more mutton.To knock out MSTN gene in sheep fetal fibroblast by CRISPR/Cas9 system and obtain MSTN gene knockout cell lines,four plasmids were designed and constructed to target MSTN gene,and confirmed correctly by sequencing.The correct plasmids were delivered into the fetal fibroblast cells.The targeting efficiency was detected using SURVEYOR assay Kit.The stable transfected cell colonies were obtained via limiting dilution procedure.The sequence results demonstrated that the pX330-target 1 and pX330-target 4 plasmids could successfully knockout MSTN gene,and the targeting efficiency were 24.20% and 10.18%,respectively.Twelve MSTN gene knockout cell colonies were obtained via limiting dilution,and one of them was homozygous mutation.Several indel mutations were discovered at specific site,and some of them were frame-shift mutation.Therefore,we concluded that the CRISPR/Cas9 system could apply to the gene editing of sheep efficiently,and the gene knockout cell clones had potential application in generating MSTN gene knockout sheep. 相似文献
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肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因突变可引起动物出现"双肌"性状,提高产肉性能。利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除的绵羊胎儿成纤维细胞,为制备MSTN基因敲除羊提供材料。设计构建4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,脂质体转染细胞后,通过SURVEYOR分析和测序等方法对敲除效率进行检测,采用极限稀释法挑选稳定敲除的细胞系。试验成功构建了4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,细胞转染后,测序结果显示pX330-target 1和pX330-target 4载体作用的靶位点处出现突变,SURVEYOR分析检测其在靶位点产生切割的效率分别为24.20%和10.18%。通过极限稀释法,获得12个MSTN基因突变的细胞克隆,其中1个为纯合突变。序列比对发现靶位点处有小片段碱基插入或缺失突变,部分会出现移码突变。成功利用CRISPR/Cas9系统实现了绵羊MSTN基因敲除,证明该系统可有效应用于绵羊基因编辑,产生的突变细胞系为制备MSTN基因敲除羊提供了材料。 相似文献
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凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。 相似文献