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1.
为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×104TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。 相似文献
2.
分别将靶向禽流感病毒(AIV)多靶点siRNA和鸡Mx基因克隆到p201慢病毒表达载体,采用鸡β-actin启动子替换p201慢病毒载体CMV启动子构建重组慢病毒载体p201-β-Mx-siRNA。并将其与辅助包装质粒共转染293T细胞,72h后收集细胞上清,实时荧光定量PCR测定重组慢病毒(rLV-MX-siR-NA)与对照组重组慢病毒(rLV-GFP)CT值,两者比较确定rLV-MX-siRNA滴度。rLV-Mx-siRNA以MOI=4感染猪胎儿成纤维细胞(PEF)并传代培养,提取后代细胞RNA检测外源基因转录以及应用间接免疫荧光试验检测鸡Mx蛋白的表达。结果表明,rLV-Mx-siRNA浓缩后滴度与已知滴度的rLV-GFP相等,为2×108 TU/mL,感染PEF效率>95%。感染rLV-Mx-siRNA的细胞传至第5代和第10代检测到外源基因转录以及鸡Mx蛋白的表达。表达鸡Mx基因和靶向AIV多靶点siRNA重组慢病毒滴度的测定与感染效率的分析,其结果为研究抗AIV转基因猪及其抗AIV的体外评价奠定了基础。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2015,(5)
为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。 相似文献
4.
《中国畜牧杂志》2015,(3)
构建冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究CIRP功能提供基础工具。本研究从4℃冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP的cDNA序列测序后,将其克隆入LV5质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组LV5-cirp表达载体与pGag/Pol、pRev、pVSV-G 3个质粒共转染到HEK-293T细胞,72 h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,以及采用Western blot方法验证基因表达情况。结果表明:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定、酶切及测序结果证明成功构建了LV5-cirp重组质粒,序列比对与设计序列符合率100%,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为6.30×108TU/m L;将制备成功的CIRP慢病毒过表达载体感染293T细胞后,Western blot检测结果显示细胞中CIRP蛋白表达水平显著高于正常细胞以及慢病毒阴性对照组(P0.01)。本实验成功构建CIRP慢病毒过表达载体并完成了慢病毒包装及滴度的测定,为今后的研究提供了基础工具。 相似文献
5.
猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。 相似文献
6.
为建立一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的系统,将从鸡DF-1细胞扩增到的gga-miR-199a前体序列克隆入pLL3.7慢病毒载体质粒中用以包装慢病毒。同时构建了更换pLL3.7质粒中鼠源U6启动子更换为鸡源及人源U6启动子的pLL3.7慢病毒载体质粒;将其与慢病毒包装辅助质粒共转至HEK293T细胞中,收集浓缩病毒颗粒并侵染细胞并获得过表达gga-miR-199a的单细胞克隆。提取单细胞克隆总RNA进行gga-miR-199a-5P的定量检测。结果表明,经慢病毒侵染后的细胞中鸡gga-miR-199a表达量显著提高,且人源U6启动子的转录效率最高,该研究成功建立了一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的慢病毒系统,说明该系统有利于在鸡活体或原代细胞中开展miRNA功能的研究。 相似文献
7.
为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：... 相似文献
8.
《中国预防兽医学报》2015,(6)
为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。 相似文献
9.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(11)
为了获得可在细胞内表达布鲁氏杆菌外膜蛋白31(OMP31)基因的表达载体和慢病毒,试验从羊布鲁氏杆菌M5-90疫苗株PCR获得OMP31基因,连接至p Zero Back/blunt载体,经双酶切鉴定、测序鉴定正确的基因亚克隆到p HAGE-CMV-MCS-IZs Green表达载体上,双酶切鉴定,构建含正确OMP31基因的表达载体p HAGE-OMP31,与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共转染293FT细胞进行慢病毒Lentivirus-OMP31包装;获得的Lentivirus-OMP31感染293FT细胞,利用蛋白质印迹(Western-blot)和免疫荧光(IFS)鉴定OMP31蛋白的表达及其免疫原性;LentivirusOMP31体外感染布鲁氏杆菌的宿主细胞模型单核细胞THP-1和人绒毛膜滋养层细胞JEG-3,Western-blot和IFS鉴定OMP31基因的表达,并利用流式细胞(FCM)检测细胞凋亡情况。结果表明:构建了能够在细胞内表达OMP31基因的真核表达载体p HAGE-OMP31和慢病毒LentivirusOMP31,二者感染细胞后表达的OMP31蛋白可与特异性抗体反应,具有良好的抗原性。经初步鉴定,OMP31蛋白在JEG-3细胞内表达能引起细胞凋亡。说明载体p HAGE-OMP31和慢病毒Lentivirus-OMP31可作为用于研究OMP31与布鲁氏杆菌感染相关性的试验材料。 相似文献
10.
为了构建猪神经介素B(pNMB)基因慢病毒过表达载体,以及研究其在猪睾丸间质细胞中稳定表达情况,试验采用RT-PCR方法扩增获得pNMB基因的CDS序列,插入到pMD-19T载体中,构建pMD19-T-pNMB重组质粒,对该重组质粒和慢病毒过表达质粒pCD513B-1进行双酶切,以获得的线性化pCD513B-1和线性化pNMB质粒构建pCD513B-1-pNMB重组慢病毒过表达载体;将重组慢病毒过表达载体pCD513B-1-pNMB和辅助质粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)共转染至HEK293T细胞中,包装获得pNMB过表达慢病毒,并用倍比稀释法测定病毒含量;用pNMB过表达慢病毒转染猪睾丸间质细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达的细胞,利用实时荧光定量PCR方法检测pNMB mRNA的表达情况。结果表明：RT-PCR扩增获得大小约为366 bp的目的片段,与GenBank中pNMB基因的CDS序列完全一致,RT-PCR扩增片段与目的片段序列完全相同;将pNMB基因克隆到pMD-19T载体中,成功构建出pMD19-T-pNMB重组质粒;XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒p... 相似文献
11.
试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。 相似文献
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13.
【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase, T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号：NZ＿CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株... 相似文献
14.
【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号：KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质... 相似文献
15.
研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。 相似文献
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【目的】 研究白细胞介素-10（IL-10）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】 利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro）进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验（IFA）观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度（TCID50）。【结果】 试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5 μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。【结论】 本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。 相似文献
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试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体（bbu-miR-302s）,对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞（iPSC）。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×106TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。 相似文献