共查询到19条相似文献，搜索用时 953 毫秒
1.
鸡毒霉形体HS株pMGA多基因族序列分析 总被引：3，自引：1，他引：2
用限制性核酸内切酶对鸡毒霉形体(MG)HS株基因文库中经初步估测可能含有的4个鸡毒霉形体粘附蛋白(protein of Mycoplasma gallisepticum adhesin,pMGA)基因的MgW17重组质粒进行了不同组合的酶消化,根据消化片段的大小及酶切位点绘制了7.5kb外源片段的物理图谱;然后根据所得的物理图谱,选用Pst I和EcoR I将MgW17外源片段酶解成1.3、2.0、4.2 kb 3个部分,将它们分别亚克隆到SK(十)质粒上,得到了3个亚克隆子SGp100、SGp200、SGp300.使用核酸外切酶Ⅲ缺失法构建缺失子系列,经序列分析后得到MgW17外源片段的全部序列.序列全长7 434 bp,中间含有2个完整的pMGA基因和另2个不完整的pMGA基因的首部和尾部,分别将它们顺次命名为H-pMGA1.1、H-pMGA1.2、H-pMGA1.3和H pMGA1.4.2个完整的pMGA基因的阅读框长度分别为1 967 bp(1.2)和2039 bp(1.3);H-pMGA1.1首部不完整的阅读框的长度为720 bp,尾部不完整的H-pMGA1.4的长度为1 752 bp.将H-pMGA基因与已报道的MG.S6株、F株的pMGA基因进行了比较,探讨了pMGA基因在不同MG菌株中的相似性、基因启动子结构的差异、间隔区内GAA重复序列对转录调控的影响等. 相似文献
2.
用限制性核酸内切酶对鸡毒霉形体(MG)HS株基因文库中经初步估测可能含有的4个鸡毒霉形体粘附蛋白(protein of Mycoplasma gallisepticum adhesin,pMAG)基因的MgW17重组质粒进行了不同组合的酶消化，根据消化片段的大小及酶切位点绘制了7．5kb外源片段的物理图谱；然后根据所得的物理图谱，选用PstI和EcoRI将MgWl7外源片段酶解成1．3、2．0、4．2kb3个部分，将它们分别亚克隆到SK^( )质粒上，得到了3个亚克隆于SGpl00、SGp200、SGp300。使用核酸外切酶Ⅲ缺失法构建缺失子系列，经序列分析后得到MgWl7外源片段的全部序列。序列全长7434bp，中间含有2个完整的pMGA基因和另2个不完整的pMGA基因的首部和尾部，分别将它们顺次命名为H—pMGAl．1、H—pMGAl．2、H—pMGAl．3和H—pMGAl．4。2个完整的pMGA基因的阅读框长度分别为1967bp(1．2)和2039bp(1．3)；H—pMGAl．1首部不完整的阅读框的长度为720bp，尾部不完整的H—pMGAl．4的长度为1752bp。将H—pMGA基因与已报道的MG．S6株、F株的pMGA基因进行了比较，探讨了pMGA基因在不同MG菌株中的相似性、基因启动子结构的差异、间隔区内GAA重复序列对转录调控的影响等。 相似文献
3.
4.
5.
鸡毒霉形体HS株pMGA多基因族的研究 总被引：2，自引：1，他引：1
鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisekpticum,GM)基因组中存在着编码细胞表面血凝粘附素蛋白（protein of Mycoplasma gallisepticum adhesin,pMGA)相关基因组的多基因族。为筛选出含有完整的pMGA基因片段，并估算出鸡毒霉形体HS株基因组中pMGA多基因族的基因数，本试验以pUC18为载体，用EcoR I限制性内切酶构建了鸡毒霉形体HS株的基因组文库。根据pMGA基因引导序列的保守区和pMGA基因间隔区的序列，人工合成了2个寡核苷酸探针（探针I、探针Ⅱ），经标记后，双筛选所建的基因文库，从600个转化子中共得到的38个含有pMGA基因的阳性克隆子，选其中1个7．5kb的片段（17号阳性克隆子，W17），用4种限制性内切酶（EcoR I,Hind Ⅲ，Pst I,Bgl Ⅱ）酶切消化，绘制了该片段的物理图谱。该片段酶切产物经电泳、转膜后与探针I和探针Ⅱ杂交，发现2个探针杂交图谱基本相同，根据杂交带及放射信号的强度值，估测出该片段含有4个pMGA基因，以这个片段所含的pMGA基因数为标准，估算出鸡毒霉形体HS株含有39个pMGA基因。 相似文献
6.
伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.对重组质粒PGTE-gD进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性.测序结果表明目的片段包含一个1203bp的开放性阅读框(ORF),编码400个氨基酸组成的多肽.将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pcDNA-gD,为下一步基因免疫奠定了基础. 相似文献
7.
伪狂犬病病毒gD、gE基因的克隆及转移载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
利用PCR扩增了伪狂犬病病毒Min-A株gD、gE基因,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.将gD、gE基因连接于质粒pUC18获得pUgDgE,缺失质粒pUgDgE的BamHI和BstEII位点间391bp的片段.在此缺失位置插入来自质粒pcD-NA3.1-的一段含hCMV启动子、多克隆位点和Neo报告基因的片段,构建了通用转移载体pgD-M-gE.该转移载体缺失了伪狂犬病病毒gI基因和gE基因ORF5'端363bp的碱基,有11个酶切位点可供外源基因的插入,上下游侧翼分别为1.25bp和1.42bp.这为开发以伪狂犬病病毒为载体的多价基因工程疫苗提供了有力工具. 相似文献
8.
为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。 相似文献
9.
地高辛标记伪狂犬病病毒（PRV）Ea株短区段蛋白激酶（PK）基因3′端0．4kb片段，Southern杂交确定短区段PK基因定位在基因组DNA BamH Ⅰ 4．0kb片段中。将该片段克隆获得重组质粒pSB304，对pSB304亚克隆，构建了仅含完整PK基因约1．3kb片段的重组质粒pSB305，并进行了序列测定。结果表明，PK基因存在2种可能的同框编码方式，分别编码388或334个氨基酸残基，并具有真核细胞蛋白激酶催化结构域序列。同国外PRV NIA-3、Ka株相比，氨基酸同源性分别为98．8％和97．3％，有意义的是Ea株、Ka株均较NIA-3株在同一位置缺失2个氨基酸（Asp，Gly）。进一步对pSB305和含gG全基因以及部分gD基因的质粒pUSK进行酶切拼接，将PK基因大部分编码区、gG基因5′端部分编码区进行缺失，构建成两端同源侧翼分别为3．1kb和1．6kb的PK、gG双缺失转移载体pLR001。上述结果为深入研究PK基因功能及研制更安全的TK^-／PK^-／gG^-三缺失基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
10.
分别以pEGFP-Mito和pAN4质粒为模板,扩增出MTS-EGFP和EcoRⅠ基因片段,利用快速体外基因重组技术-重组PCR,将两者连接得到MTS-EGFP-EcoRⅠ片段,构建克隆载体pTRE2hyg-EE,经AgeⅠ和NotⅠ双酶切得到MTS-EGFP-EcoRⅠ融合基因产物,连接克隆于真核表达质粒pEGFP-Mito后获得pMDD-Z质粒。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MTSEGFP和EcoRⅠ基因片段大小分别是831 bp和860 bp。测序结果显示,插入pTRE2hyg--EE克隆载体中的MTS-EGFPEcoRⅠ片段大小1 672 bp,且基因序列正确,没发生点突变。琼脂糖凝胶电泳结果显示,pMDD-Z质粒的双酶切产物分别为1 587 bp的插入片段和4 024 bp的载体片段。测序结果显示,pMDD-Z质粒中含1 659 bp的开放阅读框,编码553个氨基酸,从N端至C端,分别为线粒体信号导肽、绿色荧光蛋白和限制性内切酶EcoRⅠ,且未发生移码突变。 相似文献
11.
根据GenBank的核酸序列，设计6对引物自TGEV SCY株中分别扩增了长为1．5kb、2．0kb、1．1kb、1．4kb、1．4kb、1．3kb的6个片段，经克隆测序拼接后获得8495bp的TGEV部分序列。根据与其他TGEV和冠状病毒的序列和结构特征比较表明，该段序列克隆了除TGEV聚合酶基因以外的S、M、N、E、NSP3a、NSP3b、ORF7共7个基因的核酸序列；根据S、M、N基因的序列构建了系统进化树，分析表明TGEV-SCY株与TS、HN2002、TO14、pudue等毒株亲缘关系较近；密码子偏爱性分析结果认为TGEV在对密码子的使用上存在轻微的偏向性，个别氨基酸偏向于选择以A和T结尾的密码子。 相似文献
12.
Katie Miles Colin P Churchward Laura McAuliffe Roger D Ayling Robin A J Nicholas 《Journal of veterinary diagnostic investigation》2006,18(2):168-171
Mycoplasma mycoides subspecies mycoides small-colony type (M. m. m. SC) is the cause of the economically important contagious bovine pleuropneumonia. Isolates from Africa and Australia have previously been documented to have a fragment of approximately 8.84 kb, which is absent in European strains. A set of polymerase chain reaction (PCR) primers over this region was designed to identify M. m. m. SC isolates and separate European strains from those of Africa/Australia. Specificity of the PCR assay was achieved through the positioning of an oligonucleotide within the insertion sequence IS1296, upstream of this deletion, which then was paired with a reverse primer, upstream of the deletion, within the 8.84 kb-deleted region or downstream of the deletion, generating fragments of 1.1 kb (all M. m. m. SC strains), 1.4 kb (African/Australian strains only) and 1.3 kb (European strains only), respectively. Identification and differentiation was specific for DNA from M. m. m. SC with no amplification of DNA from other cluster members or closely related species. The PCR products did not require differentiation by use of a restriction endonuclease, and have potential for use in detection of this organism in clinical samples. 相似文献
13.
根据3个鸡痘病毒株的TK基因序列,借助基因分析软件设计合成了引物H1 、H2一。对PPV地方分离弱毒株PPVR的3个型PPVD(大)、PPVZ(中)、PPVX(小)和强毒株PPVY及鸽痘病毒疫苗株VVG、鸡痘病毒疫苗株VVJ进行TK基因的PCR,均成功地扩增出预期大小的目的片段。对PCR产物用限制性内切酶NcoI进行酶切分析,结果酶切产物得到两条条带,大小分别为628 bp和732 bp,与3个已发表的TK基因分析结果一致。分别将6个禽痘病毒TK基因克隆至pGEM-T Easy载体中,重组质粒经PCR和酶切鉴定后,进行测序。结果表明,本试验获得的TK基因长1 360 bp,存在一个NcoI酶切位点,两个XbaI酶切位点。序列分析表明:PPVD和PPVX同VVG和VVJ的TK基因同源性为100％;在TK基因的编码区内PPVY有一个碱基与其它毒株不同;各毒株TK基因的侧翼都存在15 bp的正向重复序列和8 bp的倒转重复序列;PPVD、PPVX和PPVZ虽然来源于同一个毒株,但TK基因存在差异。 相似文献
14.
15.
应用多重套式PCR检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鸡毒和鸡滑液支原体血凝素基因序列pMGA和vlhA各设计两对引物,建立鉴别诊断两种支原体的多重套式PCR方法,对其进行温度条件、Ⅱ步模板浓度优化及特异性、敏感性实验。该方法在两步PCR后能特异性地扩增出MG(408 bp)和MS(688 bp)两个目的片段。应用于临床样品检测,与支原体分离、SPA检测比较结果PCR灵敏度高于病原分离。 相似文献
16.
A synthetic deoxyribonucleotide probe for virulent Listeria monocytogenes, designated ADO7, was evaluated for its ability to identify restriction fragments of L. monocytogenes with nucleic acid sequences homologous with the beta-hemolysin gene by Southern blot hybridization of clinical and food isolates. The synthetic probe hybridized with three restriction fragments (approximately 1.1, 0.86, and 0.76 kb) of the serotype 1/2A isolates. Southern blot hybridization of the serogroup 4B isolates indicated that the nucleic acid sequences homologous with the beta-hemolysin gene probe were limited to a single restriction fragment of approximately 1 kb. 相似文献
17.
根据GenBank登录的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）非结构蛋白（NS）基因特征,本研究设计1对特异性引物对GPV和MDPV基因组DNA进行PCR扩增,目的片段大小均为810 bp,并对PCR产物进行切胶回收。用EcoRⅠ酶对GPV和MDPV特异性胶回收产物进行酶切鉴定,结果显示MDPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段,大小为530和280 bp;而GPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。本研究建立了一种快速区别GPV和MDPV感染的检测方法,可对番鸭感染水禽细小病毒的情况进行快速鉴别诊断。 相似文献
18.
DNA extracted from Mycobacterium paratuberculosis, which had been isolated from a cow with clinical Johne's disease, was used to make a gene library in the Escherichia Coli expression vector phage lambda gt11. Plaque-lifts were made from the library onto nitrocellulose membranes. These were screened by differential hybridization using radiolabelled chromosomal DNA from M. paratuberculosis and Mycobacterium phlei. By this method six recombinants that hybridized to M. paratuberculosis but not to M. phlei were identified. Three of these, designated lambda gt-R3, lambda gt-R4 and lambda gt-RS, containing DNA inserts of 2.5,1.5 and 3.7 kilobases (kb), respectively, were chosen for further analysis of their insert specificities. Following restriction with the endonucleases EcoRI and BamHI, the digestion fragments from the three recombinants were transferred to nitrocellulose membranes and probed with radiolabelled DNA from M. paratuberculosis and M. phlei. As expected, M. paratuberculosis DNA hybridized to all the fragments. M. phlei DNA hybridized to both the fragments that were generated from lambda gt-R3, to the single fragment from lambda gt-R4 and to two of the three fragments generated from lambda gt-RS. The fragment with which M. phlei DNA failed to hybridize was 0.45 kb in length. Multiple copies of this fragment were made in the plasmid pGEM-2; the plasmid DNA was then harvested and radiolabelled. Designated PAM-1, the radiolabelled material hybridized to a 3.7 kb fragment of EcoRI-digested M. paratuberculosis and to 2.2 kb fragments of similarly digested M. avium serovars 2 and 3. PAM-1 did not hybridize to DNA from the other four mycobacterial species examined or from Nocardia asteroides. The restriction fragment length polymorphism thus demonstrated distinguishes M. paratuberculosis from M. avium serovars 2 and 3. 相似文献
19.
菊苣质体同源片段的克隆及非抗生素标记的质体定点整合表达载体构建 总被引：2，自引：1，他引：1
依据烟草、玉米、拟南芥和大豆质体基因组rps7基因和16S rDNA基因的保守序列设计引物,以菊苣质体基因组DNA为模板,PCR扩增到1段4.8 kb的片段。序列分析表明,该片段全长4 751 bp(GenBank登录号为GQ199478),包括449 bp的 rps7基因5′端序列、793 bp的rps12基因、72 bp的trnV基因、1 315 bp的16S rDNA基因5′端以及大部分的基因间隔区,该序列与烟草对应区段的相似性为92%,与莴苣对应区段的相似性为97%。以此片段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了非抗生素标记的菊苣质体定点整合表达载体pJBADH-GFP,酶切分析及PCR检测证明构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立高效、稳定的菊苣质体转化和无抗生素筛选体系奠定基础,为进一步通过质体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣质体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。 相似文献