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1.
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《中国预防兽医学报》2020,(5)
为研究E3泛素连接酶FBXW7与PEDV感染的相互调节作用,本研究采用PEDV感染Vero E6细胞后检测FBXW7蛋白表达水平,结果显示,PEDV感染能够抑制Vero E6细胞中FBXW7的表达水平。将pCAGGS-HAFBXW7转染Vero E6细胞,通过FBXW7过表达试验评价其对PEDV感染复制的影响,western blot检测分析结果显示,过表达FBXW7显著抑制PEDV N蛋白的表达,表明FBXW7对PEDV复制有抑制作用。进一步利用荧光定量PCR检测PEDV感染条件下过表达FBXW7对干扰素及干扰素刺激基因的影响,结果显示,与pCAGGS-HA对照组对比,pCAGGS-HA-FBXW7转染细胞IFN-β、ISG15、 ISG54和ISG56的转录水平均显著提高(p0.05),表明PEDV感染可通过下调FBXW7的表达拮抗宿主天然免疫应答促进其感染复制。本研究阐明了一种PEDV拮抗宿主天然免疫的新策略。 相似文献
3.
《畜牧兽医学报》2017,(3)
为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白7(nonstructural protein 7,Nsp7)的亚细胞定位和对细胞Ⅰ型干扰素(IFN)应答的影响,本试验利用生物信息学预测Nsp7基因序列,克隆了PEDV中国流行毒株Nsp7基因并构建真核表达载体pCAGGS-Nsp7;采用Western blot和间接免疫荧光试验检测Nsp7在细胞中的表达和分布;通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估Nsp7对Ⅰ型IFN应答的影响。基因克隆和序列分析结果显示PEDV Nsp7基因大小为249bp,在不同PEDV毒株间高度保守;Western blot结果显示,Nsp7能够在转染细胞中高效表达;间接免疫荧光试验显示Nsp7主要定位在细胞质,仅少量分布在细胞核;双荧光报告基因试验表明Nsp7能显著抑制IFN-β启动子活性,ELISA结果显示Nsp7能显著抑制IFN-β蛋白的表达,同时水疱性口炎病毒复制抑制试验显示Nsp7明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,Nsp7作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型IFN应答的功能,为探讨和揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制及指导临床疫苗使用奠定基础。 相似文献
4.
《畜牧兽医学报》2015,(10)
宿主蛋白质广泛参与流感病毒基因组在宿主体内的转录、复制和翻译。病毒蛋白质和宿主蛋白质的互作对于病毒的感染有重要影响。PA-N182是新发现的PA基因的转录形式,关于其宿主互作蛋白质的研究目前尚少。COPD(coatomer protein complex,subunit delta)是负责细胞内新合成蛋白质从内质网向高尔基体转运的基因,COPD基因敲除后细胞内流感病毒滴度降低,表明COPD基因可能参与流感病毒的复制。COPD基因影响流感病毒感染的机制仍未见报道。本研究通过构建PA-N182和COPD过表达载体并共转染细胞,利用免疫共沉淀、Western blot的方法,证实在鸡细胞内H5N1禽流感病毒PA-N182蛋白和COPD蛋白有相互作用,表明COPD对流感病毒感染的影响可能与其和PA-N182蛋白的互作并影响PA-N182蛋白从宿主细胞内质网向高尔基体的转运有着密切的联系。 相似文献
5.
《畜牧与兽医》2017,(11):87-91
为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白7(Nsp7)的结构特征和免疫原性,本研究通过生物信息学分析Nsp7蛋白序列特征及空间结构,在此基础上对Nsp7进行原核表达和纯化,并制备抗Nsp7多克隆抗体。结果显示,Nsp7基因在PEDV不同毒株间高度保守,Nsp7蛋白的三级结构主要由4个α螺旋片组成。SDS-PAGE试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,重组蛋白大小为9.2 ku,经纯化后得到单一条带。采用纯化的Nsp7免疫兔制备多克隆抗体,然后经Western blot和间接免疫荧光试验鉴定,多克隆抗体能够特异性识别重组Nsp7蛋白和PEDV感染细胞的Nsp7蛋白,证明Nsp7免疫原性良好,为后续研究Nsp7的功能及研制以Nsp7为检测靶标的PEDV诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
6.
猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病，可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻，造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响，本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及测定病毒半数组织细胞感染量TCID50等方法，通过检测在DCD的作用下PEDV在细胞中的基因转录、蛋白表达和病毒滴度的水平，并利用Western blot检测信号通路中蛋白表达水平，探究其作用的分子机制。研究表明，DCD能够参与PEDV感染；DCD过表达促进了PEDV在Vero细胞和LLC-PK1细胞中的复制，而敲低DCD抑制了PEDV复制；DCD通过诱导PTEN表达来抑制Akt-mTOR-p70S6K通路相关蛋白位点的磷酸化，从而介导自噬促进PEDV复制。研究DCD对PEDV复制的作用机制，对今后PEDV防治工作有重要参考意义。 相似文献
7.
利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。 相似文献
8.
9.
《中国预防兽医学报》2015,(9)
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白Nsp9为该病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp),在病毒的转录复制过程中发挥关键性作用。为筛选与Nsp9相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交方法,以PRRSV Nsp9为诱饵蛋白,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)酵母表达c DNA文库中筛选到CALM2(Calmodulin 2)基因。酵母回返验证试验和免疫共沉淀(Co-IP)试验证明CALM2基因编码的钙调蛋白(Ca M)与Nsp9特异地相互作用。激光共聚焦试验表明Ca M与Nsp9共定位于HEK293细胞胞浆内。本研究筛选到一个与Nsp9相互作用的新宿主蛋白Ca M,但该蛋白是否直接参与PRRSV的复制过程还有待进一步研究。 相似文献
10.
《畜牧与兽医》2020,(11)
为进一步研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染细胞的机制,本研究利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)和质谱(MS)技术筛选细胞内与PEDV相互作用的蛋白,初步鉴定细胞内源性蛋白甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子II受体(M6P/IGF2R)为候选蛋白。结果证实M6P/IGF2R蛋白与PEDV S2蛋白相互作用且在细胞内存在共定位现象,过表达M6P/IGF2R能够促进PEDV增殖,干扰M6P/IGF2R能够抑制PEDV增殖。PEDV S2蛋白通过与宿主细胞M6P/IGF2R蛋白互作促进PEDV侵入细胞,该结论为进一步开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用机制研究提供了重要理论依据。 相似文献
11.
利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。 相似文献
12.
为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。 相似文献
13.
旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru, PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达，明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段，将其转染至Vero-E6细胞，PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平；RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平，同时检测PEDV滴度变化，以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明：PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时，试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，在48 h时表达量最高，且差异极显著(P<0.01),自噬被激活；RT-qPCR结果显示，TRIM5α的表... 相似文献
14.
《中国预防兽医学报》2017,(11)
为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白与宿主细胞中的互作蛋白,本研究构建PEDV N蛋白基因的重组载体p GBKT7-N,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)cDNA文库中筛选出与N蛋白相互作用的蛋白。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中不存在毒性和自激活作用,而且筛选出6种与N蛋白互作的蛋白,分别为FTH1、LGALS3、CORO1C、SNRPG、KRTAP5-3和ZNF598。其中半乳糖凝集素3(LGALS3)和小核糖蛋白G(SNRPG)通过回返试验和免疫共沉淀试验证实其与PEDV的N蛋白存在特异性相互作用。本研究为进一步研究PEDVN蛋白的功能及病毒的致病机制奠定了基础。 相似文献
15.
《中国兽医杂志》2020,(1)
为了研究猪红细胞免疫粘附病原体的分子机制,筛选能与猪红细胞类补体受体I型(CR1-like)蛋白发生相互作用的蛋白,将CR1-like36和Cr1-like811基因与pGBKT7载体连接后,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811。转化入酵母细胞Y2HGold中,检测融合蛋白的表达及其对酵母细胞的毒性和自激活现象。结果表明,CR1-like基因成功连接到pGBKT7载体,重组质粒表达的融合蛋白对酵母细胞无毒性作用,也无自激活现象。成功构建了符合酵母双杂交系统要求的诱饵质粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811,为课题组后期研究猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的分子机理奠定基础。 相似文献
16.
为探究NS4B蛋白在牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染和复制过程中的作用，利用酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H)技术筛选与BVDV NS4B蛋白互作的宿主细胞蛋白质。以构建的BVDV NS4B重组质粒pGBKT7-NS4B作为诱饵质粒，采用酵母双杂交技术，与牛肾细胞MDBK-cDNA文库进行杂交。将获得的阳性克隆菌落经质粒抽提、测序分析和免疫共沉淀试验，确定可与NS4B互作的宿主细胞蛋白。结果表明，成功构建了诱饵质粒pGBKT7-NS4B,该质粒可在酵母菌中表达NS4B蛋白。采用酵母双杂交技术从牛肾细胞基因组文库获得14个阳性克隆，阳性克隆经测序、互补试验、免疫共沉淀验证后明确可与BVDV NS4B蛋白互作的宿主蛋白为SYNGR2和RABACI。上述研究为进一步研究BVDV NS4B蛋白在BVDV感染和复制中的作用机制奠定了理论基础。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2017,(2)
流感病毒的核衣壳蛋白(NP)是病毒粒子中重要的结构蛋白,参与流感病毒生命周期的多个过程。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究应用酵母双杂交技术(Y2H)技术从A549细胞cDNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Tribble 2(TRIB2),并通过免疫共沉淀技术(Co-IP)试验和GST pull down试验进一步证实NP与TRIB2之间存在特异性的直接相互作用。此外,利用激光共聚焦试验证实NP与TRIB2共定位于A549细胞的细胞质内。在A549细胞中过表达TRIB2蛋白后,能够降低流感病毒的滴度,表明TRIB2具有抑制流感病毒的复制功能。本实验为研究流感病毒的复制机理奠定了基础,完善了病毒与宿主相互作用网络。 相似文献
18.
旨在筛选并鉴定与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)相互作用的宿主蛋白。本试验通过构建猪肺酵母cDNA文库、酵母双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦、过表达和干扰试验等手段,筛选与N蛋白互作的宿主蛋白并研究其对PRRSV复制的影响。结果显示：N蛋白和核糖体蛋白S20(RPS20)在酵母细胞内发生互作,免疫共沉淀和激光共聚焦试验进一步确定N蛋白和RPS20蛋白互作并共定位于细胞质中。过表达和干扰试验证实RPS20能够影响HP-PRRSV在细胞内的增殖。本研究丰富了PRRSV与宿主因子互作的网络,为进一步研究RPS20蛋白在PRRSV感染过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
19.
为筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的因子,本研究以抱雌沟蛋白（gynecophoral canal protein ofSchistosoma japonicum,SjGCP）为诱饵蛋白构建了用于酵母双杂交筛选系统的重组质粒。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因序列设计引物,经过PCR扩增、酶切回收,与经相应酶切的线性化载体pBGKT7-BD连接构建重组质粒。随后将重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP转化酵母菌株,测定融合蛋白BD-SjGCP在酵母菌中的自激活活性、对酵母菌生长的影响及在酵母中的表达情况。结果显示构建的重组诱饵蛋白质粒pGBKT7-BD-SjGCP能够在酵母细胞内正确表达,没有独自激活报告基因表达的活性,且其表达对酵母细胞没有毒性,不影响酵母细胞的生长。可见,重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP可用于筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的物质。 相似文献
20.
为进一步探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白7(Nsp7)在病毒复制过程中发挥的生物学作用,本研究在获得Nsp7可溶性重组蛋白的基础上,首先制备了抗Nsp7蛋白兔源多克隆抗体。确定抗体的免疫活性后,将其与PRRSV共同接种Marc-145细胞。孵育1h后弃掉混合物,加细胞维持液继续培养48h,应用TaqMan探针Real Time PCR方法对培养物中病毒拷贝数进行检查。结果显示,本研究制备的多克隆抗体可以和大肠杆菌表达的Nsp7α、Nsp7β重组蛋白发生特异性结合,并有效用于病毒感染Marc-145细胞后其Nsp7蛋白分布情况的原位检测;更为重要的是,与正常家兔血清相比,不同稀释倍数的抗Nsp7多克隆抗体均可对病毒的复制产生抑制作用,其中10-3倍稀释血清的抑制率可达88.4%。结果表明,Nsp7特异性抗体可有效用于PRRSV抑制试验的研究;Nsp7作为PRRSV复制酶多聚蛋白成员之一,在病毒复制过程中发挥着重要作用。 相似文献