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为了进一步研究布鲁氏菌外膜蛋白19（outer membrane protein 19,OMP19）的结构与功能,并获得具有反应原性的OMP19重组蛋白,建立布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法,试验通过生物信息学软件对OMP19蛋白进行氨基酸序列分析,经PCR技术克隆Omp19基因,利用无缝克隆技术构建重组表达载体pET-32a-Omp19,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导其表达并纯化,并通过Western blotting和ELISA分析方法分别检测OMP19蛋白的反应原性,以建立基于该蛋白的间接ELISA方法。结果显示,OMP19蛋白N端有19个信号肽序列,二级结构以无规则卷曲为主,且OMP19蛋白含有优势抗原表位,利用PCR技术和无缝克隆技术成功构建了Omp19基因的原核表达载体pET-32a-Omp19,成功诱导表达并纯化了OMP19融合蛋白,大小约为35 ku,与理论值相符,并通过Western blotting和ELISA方法鉴定OMP19的反应原性,结果表明该蛋白具有较好的反应原性,且包被浓度为10 μg/mL,一抗稀释比为1：50,二抗稀释比为1：8 000时,P/N值最大,为2.80。本研究结果为布鲁氏菌病快速诊断方法的建立和新型疫苗的研发奠定了理论基础。 相似文献
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为鉴别我国牛种布鲁菌弱毒疫苗株A19与野生菌株,运用生物信息学方法结合基因测序,对疫苗株A19基因组SNP位点分析筛选,选取其中部分SNP位点,通过与布鲁菌常见种、生物型标准参考菌株和弱毒疫苗株基因组SNP位置核苷酸测序比较,验证SNP位点的A19特异性。结果表明,共筛选获得A19基因组29个SNP位点,验证ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503这3个SNP位点为A19（或S19）特异,揭示了A19基因组SNP位点分布情况,为疫苗株 A19与野生菌株鉴别提供了分子依据。 相似文献
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研究目的:通过检测H19在骨损伤之后愈合过程中的表达变化探讨骨损失愈合的相关细胞和H19的关系.研究方法:大鼠左后肢股骨做骨缺损造模,右后肢股骨做假手术处理.于5d、10d、15d、20d、25d断颈法处死.实时荧光定量PCR测定H19表达.研究结果:在5d到25d中,H19在损伤组和对照组均有表达;损伤后5d,实验组H19的表达量是对照组的两倍;损伤后10d,实验组H19的表达量是对照组的两倍;损伤后15d、20d、25d,实验组H19的表达量和对照组H19的表达量基本持平.研究结论:H19促进骨细胞的增殖与分化,可加速骨损伤的愈合. 相似文献
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对羊布鲁菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达。利用GenBank中收录的布鲁菌(KT229642.1)OMP19基因序列,设计合成引物,应用PCR技术扩增OMP19基因,并将OMP19基因连接到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET28a-OMP19,转化到BL21感受态细胞进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法分析。结果克隆了羊布鲁菌陕西分离株OMP19全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株OMP19基因与国内外已报道的羊布鲁菌核苷酸同源性超过98%,氨基酸同源性超过98%。OMP19重组菌经诱导表达约为19ku的重组蛋白,该蛋白能与本实验室鉴定保存的阳性血清特异性结合,反应原性良好。为羊布鲁菌陕西分离株分子生物学特性研究提供资料,为进一步进行基因工程疫苗研制及ELISA试剂盒抗体检测提供了基础。 相似文献
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[目的]构建以及鉴定牛lncRNA H19过表达重组载体,为进一步探究lncRNA H19与miRNA 491和牛CART基因的互作关系奠定试验基础。[方法]NCBI获取牛lncRNA H19序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,双酶切后载入pcDNA3.1-EGFP载体得到重组质粒。将pcDNA3.1-EGFP-H19、miRNA 491和CART 3种质粒共转染至HEK293T细胞,在细胞内反复扩增过表达之后,利用荧光定量技术检测pcDNA3.1-EGFP-H19的表达量。[结果]结果显示pcDNA3.1-EGFP-H19载体序列正确;293T细胞绿色荧光达50%,且强度适中,说明转染效果良好;lncRNA H19在293T细胞中显著表达。[结论]pcDNA3.1-EGFP-H19载体构建成功,试验将为后续探究lncRNA H19与miRNA 491和CART基因之间的互作关系创造试验条件。 相似文献
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CYP2C19基因多态性与肿瘤易感性关系的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)又称S-美芬妥英羟化酶,是一种重要的肝微粒体酶,该酶的羟化代谢在人群中呈二态分布,即S-美芬妥英4′-羟化强代谢者( EMs)和弱代谢者( PMs).CYP2C19ml和CYP2C19m2突变是PMs产生的主要原因.CYP2C19表型和基因型的遗传多态性决定了不同个体对致癌物代谢的差异性和肿瘤的化学致癌易感性.CYP2C19与消化道肿瘤(包括食管癌、胃癌、肝癌)、肺癌、急性白血病、膀胱癌等发病有关.通常认为CYP2C19的PM个体可能存在肿瘤易感性,但是膀胱癌的PM发生率显著低于正常对照组.论文综述了近年来CYP2C19基因多态性和肿瘤易感性的相关研究. 相似文献
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本试验旨在研究长链非编码RNA(H19)在骨骼肌发育和损伤修复过程中表达量的变化,为研究H19在小鼠骨骼肌发育中的作用机制奠定基础。以C2C12细胞系和ICR小鼠为试验素材,通过生物信息学方法分析H19的非编码特性和在物种间的低保守性,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测H19在C2C12细胞分化,ICR小鼠骨骼肌发育不同时期和成体小鼠骨骼肌损伤修复过程中表达量的动态变化。结果表明,H19在小鼠骨骼肌中的表达量随出生后日龄的增长逐渐下降;在诱导C2C12细胞分化过程中,H19的表达量先是逐渐升高,进而在较高水平维持不变;在肌肉损伤模型中修复的第4~6天,H19的表达量维持在较高水平。鉴于上述H19在C2C12细胞分化和肌损伤修复过程中的表达特点,推断H19可能具有促进肌纤维形成和成体骨骼肌损伤后修复的功能。 相似文献
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通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】 扩增牛妊娠相关蛋白19(bovine pregnancy-associated glycoprotein 19,BoPAG19)基因,构建真核表达载体,并检测其在HEK-293F细胞中的表达。【方法】 根据BoPAG19基因序列(GenBank登录号:NM_176628)体外合成BoPAG19基因,PCR扩增目的基因,经双酶切后与真核表达载体pcMV3连接,构建pcMV3-BoPAG19重组质粒。采用Lipofectamine®2000将重组质粒瞬时转染至HEK-293F细胞,SDS-PAGE法鉴定细胞培养上清中BoPAG19蛋白的表达,采用亲和层析法纯化BoPAG19蛋白。通过在线工具分析BoPAG19蛋白的疏水性、跨膜区域、信号肽、B细胞抗原、二级结构、三级结构和蛋白相互作用。【结果】 成功构建pcMV3-BoPAG19重组载体,目的基因长约1 200 bp,表达蛋白约60 ku。生物信息学分析显示,BoPAG19蛋白编码380个氨基酸,其中含量最高的是丝氨酸(Ser),占比9.2%,含量最低的是色氨酸(Trp),占比1.6%;分子式为C1937H3028N524O532S15,理论分子质量为41.8 ku,等电点为9.62,不稳定指数为40.75,在水中不稳定,脂肪系数为91.53,消光系数为52 370 mol-1·cm-1,具有水溶性;含有1个信号肽,无跨膜区域,有6个糖基化位点和11个B细胞表位;二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链占比分别为18.95%、6.32%、42.37%和32.37%,三级结构预测结果与二级结构一致。与BoPAG19互作的蛋白包括APLP2和APP,可能参与了妊娠期的神经调节。【结论】 试验成功表达、纯化了BoPAG19蛋白,并分析了BoPAG19的生物信息学特征,为BoPAG19蛋白的结构和功能研究,以及BoPAG19诊断奠定基础。 相似文献
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通过构建标记疫苗株来解决流产布氏杆菌(B.abortus)鉴别诊断方面的缺陷,本研究以bp26基因作为重组靶住点,S19为亲本,利用bp26基因ORF外侧序列作为同源重组序列,卡那霉素抗性基因(Kanr)为抗性筛选标记,通过双交叉重组筛选获得bp26基因缺失突变的重组S19株,命名为S19-△26.小鼠感染结果表明,突变株S19-△26的残留毒力与亲本株S19相比较没有发生明显改变,康复时间约为15周,突变株S19-△26、亲本株S19和B.abortus强毒株S544接种小鼠后的第3周能检测出"O"抗原的特异性抗体,而第6周开始S19和S544接种小鼠BP26特异性抗体明显升高,S19-△26接种的小鼠一直没检测到BP26特异性抗体.小鼠免疫保护试验显示,脾脏分离CFU数比空白对照要低310g10,S544攻击后脾脏细菌分离数表明突变株具有与亲本疫苗株免疫保护性无明显差异.结果表明,S19-△26免疫能够通过血清学方法与野生型B.abortus感染后的免疫反应相区别,具备作为标记疫苗的潜力. 相似文献
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为进一步明确貂源冠状病毒与新型人冠状病毒HCoV-19的遗传进化关系,比较了NCBI上公布的3株水貂冠状病毒、5株雪貂冠状病毒以及人冠状病毒HCoV-19和SARS-Cov的全基因组、ORF1a、ORF1ab和病毒表面蛋白Spike的序列同源性,分析了其遗传进化关系,以及组成病毒的结构蛋白和非结构蛋白的种类、基因位置及氨基酸数量。结果显示:貂源冠状病毒与新型冠状病毒HCoV-19全基因组、ORF1a、ORF1ab、Spike蛋白的相似性分别为68%、46.96%、52.44%、47.36%;貂源冠状病毒与HCoV-19不属于同一分支,且亲缘关系较远;同时,貂源冠状病毒与HCoV-19全基因组在蛋白组成、氨基酸数量、基因位置上均存在显著差异。结果表明,貂源冠状病毒与新型冠状病毒HCoV-19不是同一种冠状病毒,此次在人群中流行的新型冠状病毒HCoV-19由貂源冠状病毒重组而成的可能性很小,因此可初步排除HCoV-19来源于水貂和雪貂的可能性。 相似文献
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重组布鲁菌外膜蛋白Omp的制备方法及免疫原性研究 《畜牧与饲料科学》2022,43(3):1-7
[目的]探索重组布鲁菌Omp19蛋白的制备方法,评价其在实验动物中的免疫原性,为中试工艺放大奠定基础。[方法]利用摇瓶培养对重组Omp19蛋白进行原核诱导表达,对培养基类型、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间、诱导时的菌体密度等条件进行筛选;利用阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析对重组Omp19蛋白进行纯化制备;利用SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）对重组Omp19蛋白的纯度进行鉴定;利用动物实验评价制备的重组Omp19蛋白的免疫原性。[结果]摇瓶培养试验表明,重组布鲁菌Omp19蛋白较优的表达条件为：使用LB培养基,在菌密度OD600 nm值为0.6~1.0时加入0.5 mmol/L的IPTG,于28 ℃诱导5 h;经3步纯化后,获得了高纯度的重组Omp19蛋白;免疫原性研究表明,经方法优化后制备的重组Omp19蛋白联合佐剂可以较好地刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体。[结论]优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法,评价了其在小鼠中的免疫原性,为重组布鲁菌疫苗的研发提供了实验基础。 相似文献
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通过对绿色荧光蛋白（GFP）布鲁氏菌弱菌株M5（GFP-M5）和S19（GFP-S19）侵染小鼠巨噬细胞（RAW264.7）及对其与胞内溶酶体、内质网、高尔基体初次结合所用时间进行测定,探讨分析两种布鲁氏菌弱毒株侵染小鼠巨噬细胞过程的荧光表征。将GFP-M5和GFP-S19分不同时间段分别侵染RAW264.7,利用激光共聚焦和流式细胞仪观察和检测。结果显示,GFP-M5和GFP-S19均构建成功。布鲁氏菌M5和S19及GFP-M5和GFP-S19侵染RAW264.7后胞内生存能力无明显差异。GFP-M5和GFP-S19侵染30 min后均已进入小鼠巨噬细胞,2 h分别到达溶酶体、内质网和高尔基体。而两种弱毒株在1、2、3、4 h与各细胞器结合率相近。流式细胞仪检测结果显示,GFP-M5和GFP-S19侵染RAW264.7的GFP+细胞含量无显著差异（P>0.05）。结果提示,两种弱毒株在侵染进入宿主细胞的初期及侵袭能力并没有明显差异。 相似文献
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布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-2的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF^＋替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S19-2。用PCR与萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达的方法进行验证,结果表明Bp26基因与Bmp18基因改造成功,△S19-2具有Bp26基因分子标记、Bmp18毒力基因缺失的特点。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(3)
为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。 相似文献
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从湖北省某猪场分离了一株猪蓝耳病毒(CH-WH-19)，其基因组全长是14993 bp。同源性分析结果显示CH-WH-19与NADC30、JXA1、CH-1a、VR-2332和GM2的相似性分别为91.9%、84.3%、83.9%、83.3%和80.5%，但是与欧洲型的毒株Lelystad virus相似性仅有58.9%。GP5基因和全基因组的进化树分析显示，CH-WH-19与NADC30毒株处于同一分支。Nsp2基因氨基酸比对结果发现，CH-WH-19和NADC30毒株与VR2332毒株相比具有不连续的131个氨基酸缺失的特征。同源性和进化树的结果都显示了CH-WH-19属于新变异的类NADC30毒株。GP5序列比对结果表明，CH-WH-19有一些氨基酸的突变，A137是疫苗株VR2332的标志，但CH-WH-19毒株突变成了S，N34是四个潜在的N-糖基化位点之一，突变成了D。试验表明，本研究分离了一株变异的NADC30毒株，生物学特性分析也表明属于类NADC30毒株。 相似文献