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1.
伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。 相似文献
2.
为建立一种简便、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）3种病原的多重PCR方法，针对PRRSVN基因、PPVVP2基因及PRVgp50基因分别合成了1对特异性引物，通过PCR均扩增出分子长377bp、445bp和217bp的DNA条带，与预期扩增片段相符。以3对引物同时对PRRSV、PPV和PRV疫苗株进行多重PCR扩增及反应条件的优化，同时扩增出3条特异性条带。利用所建立的多重PCR方法，对贵州省11个养猪场的40份疑似病料进行检测，结果显示，PRRSV、PPV和PRV的阳性检出率分别为62．5％、17．5％和0％。 相似文献
3.
2014年9月山东潍坊某猪场发生疑似猪伪狂犬病疫情,采集病死仔猪的脑组织等,利用Vero细胞做病毒分离,并设计一对伪狂犬病病毒(PRV)gE基因片段的特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定及家兔接种试验.结果表明:脑组织上清液接种Vero细胞后有典型的细胞病变;PCR扩增产物电泳后显示出990bp长的目的片段,目的片段基因序列与6株PRV毒株的gE基因序列核苷酸同源性在97.7％～ 100％之间,证实该病毒为PRV;分离病毒接种家兔出现典型的伪狂犬病症状.临床诊断结合实验室鉴定以及动物接种试验,确诊该病例为猪伪狂犬病. 相似文献
4.
[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用 Vero 细胞从疑似伪狂犬病病毒（PRV）引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株 gE基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株 PRV 毒株,命名为 PRV N5B 株,该病毒能在 Vero 细胞上增值,在15代 TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;gE基因全长1740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%～100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒（106/0.1 ml）滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的 PRV N5B分离株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。 相似文献
5.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2015,(5)
[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用Vero细胞从疑似伪狂犬病病毒(PRV)引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株g E基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株PRV毒株,命名为PRV N5B株,该病毒能在Vero细胞上增值,在15代TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;g E基因全长1 740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%~100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒(106/0.1 ml)滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的PRV N5B分离株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。 相似文献
6.
多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究 总被引：3，自引：1，他引：2
根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断. 相似文献
7.
【目的】建立可用于临床同时检测PCV-2、PPV和PRV 3种DNA病毒感染的多重PCR方法。【方法】根据GenBank中收录的PCV-2、PPV和PRV的基因组序列,选择3种病毒的特异性保守区设计3对引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重PCR方法,对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行检测,并将其用于临床病料的检测。【结果】多重PCR方法中,当引物浓度均为1.0μmol/L,退火温度为57.2℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从PCV-2、PPV、PRV病毒DNA中分别扩增出长度为353,265和198bp的目的片段,从3种病毒DNA的混合物中也可扩增出上述目的片段,而其他对照组的扩增结果均呈阴性。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR方法对PCV-2、PPV和PRV的最低检测量分别为26.88,25.34和24.9pg/μL。在不同时间对每份样品重复检测3次,结果一致,表明该方法具有良好的可重复性。临床应用结果表明,39份疑似病料中,PCV-2、PPV和PRV的阳性率分别为53.84%,17.95%和5.13%,PCV-2与PPV混合感染的阳性率为15.38%,PCV-2、PPV和PRV混合感染的阳性率为2.57%。【结论】建立的多重PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可以有效检测PCV-2、PPV和PRV的混合感染。 相似文献
8.
用PCR方法扩增伪狂犬病病毒(PRV)的gB基因片段,构建含有gB基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRV-gB基因重组质粒为模板应用SYBR Green I方法来建立检测PRV-gB基因载量的荧光定量PCR方法。结果显示:在(8.6×107~8.6×101)copies/μL范围内,回归方程为y=-3.5604x+41.165,其决定系数为0.9993,显示出优良的线性关系;扩增产物的熔解曲线仅有一个特异性单峰。该方法对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪细环病毒等常见猪源DNA病毒进行检测时均没有扩增曲线,重复性试验的变异系数小于2%,表明建立了特异性强、重复性好、灵敏性高的PRV-gB基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。用该方法检测8种商品伪狂犬病弱毒活疫苗的每头份剂量的病毒载量,结果显示不同商品伪狂犬病弱毒活疫苗之间的病毒载量存在明显差异,与其标识剂量基本一致,表明该荧光定量PCR检测方法可用于疫苗剂量检测。 相似文献
9.
Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒 总被引：4，自引：0，他引：4
选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测. 相似文献
10.
[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查. 相似文献
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陕西省猪伪狂犬病流行病学调查和WG株的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
应用gE-EL ISA法对陕西省部分地区6个集约化猪场的187份猪血清进行了伪狂犬病毒(P seu-dorab ies v irus,PRV)野毒感染检测,并对疑似伪狂犬病发病仔猪的内脏及脑组织进行了病毒分离鉴定。结果显示,陕西省猪PRV野毒抗体平均阳性率为28.76%,最高为48.98%,最低为0;分离毒株可致PK-15细胞出现典型的圆缩、集聚,脱落等细胞病变,连续传代后,CPE出现的时间稳定在20 h左右;细胞培养物和病料混悬液接种家兔均出现典型奇痒症状,PCR反应扩增出PRV gE基因中长度为612 bp的特异性片段。表明本试验分离的病毒为PRV,并将其命名为PRV W G株。 相似文献
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为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。 相似文献
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根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。 相似文献
15.
根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品.通过对SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒.试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL.结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2基因缺失株RT-PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：1，他引：2
为了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) nsp2基因缺失流行株,在对不同PRRSV分离株nsp2基因核苷酸序列分析的基础上,设计了针对nsp2基因的1对兼并PCR引物和1条基因特异性反转录引物.RT-PCR试验结果表明,经典PRRSV S1毒株和高致病性nsp2缺失株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别为768 bp和678 bp.特异性试验和敏感性试验证明,该检测方法特异性较好,但敏感性相对较低,可用于快速鉴别诊断PRRSV nsp2基因缺失毒株和经典PRRSV毒株. 相似文献
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伪狂犬病病毒Min-A株TK基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒TK基因的序列设计了1对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体．对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性．测序结果表明目的片段包含1个957bp的开放性阅读框(ORF),编码318个氨基酸组成的多肽．在TK ORF上游-22,-166,-199位存在3个GC框样序列,在终止密码子下游第110个核苷酸处的l306位存在有多聚腺苷加尾信号．PRV Min-A株与PRV Ea株、NIA-3株TK的核苷酸同源性分别为98．4％,97．9％;推导氨基酸的同源性分别为97．8％,97.2％．通过对α疱疹病毒TK氨基酸进行多序列比较．获得了在PRV TK氨基酸序列上的6个保守区间．推测这些保守氨基酸对于胸苷激酶(TK)结构的稳定性和催化活性的发挥是必需的。 相似文献
18.
为了对河北某免疫猪场发生的疑似猪伪狂犬病进行确诊,并针对猪伪狂犬病毒开展进一步的研究工作,本试验对该猪场送检的病猪进行剖检,将其脾、肺、肾及淋巴结的混合研磨液经PK15细胞接种分离,后经PCR扩增及动物回归试验,证实成功分离的病毒为伪狂犬病毒(PRV),并命名为SH151218。根据GenBank上传的PRV及其gE基因序列,设计了1对检测引物以及1对扩增gE基因的引物,并对其gE基因进行了序列分析,SH株属于GI亚型,与哈尔滨变异株同源性最高,所分离的PRV毒株为变异强毒株。此变异株的发现对PRV变异机制的研究及研制新疫苗提供了基础。 相似文献
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种番鸭产蛋下降综合征病毒的分离及其PCR鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从临床表现产蛋率下降、产蛋异常的种番鸭输卵管粘膜中分离到1株病毒,经血凝及血凝抑制试验鉴定为产蛋下降综合征病毒,命名为E05。参照GenBank上发表的鸭源产蛋下降综合征病毒基因组序列的保守区设计1对引物,通过PCR技术扩增出286 bp的基因片段,将扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞,筛选出阳性重组质粒进行测序分析。测序结果与GenBank上已发表的EDSV 100kD蛋白序列比对,扩增片段与已登陆的基因片段完全相符,同源性100%。 相似文献
20.
猪细小病毒和猪伪狂犬病毒复合PCR检测方法的建立 总被引：12，自引：0，他引：12
在已经建立的PPV和PRV的单项PCR诊断方法的基础上。通过对扩增条件的筛选，成功地建立了PPV和PRV诊断方法，并应用于临床，利用一次PCR反应，即可同时扩增PPV的445bp和PRV217bp的特异性片段。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。 相似文献