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【目的】分离鸡传染性支气管炎病毒河南地方株,并对其进行鉴定。【方法】采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用;通过酶处理、病毒干扰试验、动物回归试验、理化试验等研究病毒的特性;利用电镜观察病毒的形态,应用RT-PCR方法扩增分离毒株的S1和N基因片段。【结果】病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚,将病毒盲传至第8代时,病毒的毒力逐渐由104.0增强到107.2;经质量分数1%胰酶处理或用磷酸酯酶C处理的病毒液能够明显凝集质量分数1%鸡红细胞,血凝滴度分别在29和27左右;病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖,单独接种分离毒株的尿囊液HA滴度平均为20,先接种HN99毒株再接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为23,同时接种HN99毒株和NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为28.5,单独接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为29;病毒可致SPF雏鸡发病,引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变;该毒株对乙醚和氯仿敏感,耐酸不耐碱,对热敏感;病毒粒子直径90~105 nm;扩增到了分离毒株S1基因片段大小为1 739 bp(含前导序列),N基因全长为1 230 bp,通过与其他IBV毒株进行系统进化分析,证明分离毒株与其他毒株的亲缘关系较远。【结论】初步证实分离的病毒为肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为HN99株。 相似文献
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污染疫苗的禽腺病毒分离和鉴定 总被引：1，自引：1，他引：1
在用非免疫鸡胚增殖鸭病毒性肝炎病毒(E52株)过程中，发现种毒受到污染。采用聚乙二醇沉淀．Sephadex G100柱层析法纯化污染病毒，在电镜下发现一大小为70～80nm，无囊膜，20面体对称的病毒颗粒。挑选4条随机引物对其进行反转录PCR扩增，共扩增出3条基因片段。序列分析结果表明，与禽腺病毒(鸡胚致死孤儿病毒)基因组部分序列同源性分别高达99．5％、99．6％和99．5％，从而证明禽腺病毒污染了鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
通过鸡胚接种和鸡胚成纤维单层细胞培养相结合的方法从江西省某猪场死亡仔猪的脑、肺脏中分离到一株病毒。该病毒接种家兔48 h后开始表现不安,呈奇痒为特征的神经症状并死亡。病毒能在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑,在鸡胚成纤维细胞中增殖并使细胞出现病变、死亡。电镜观察到病毒粒子呈圆形,囊膜清晰可见,直径130~170 nm。根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性953 pb DNA片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,命名为伪狂犬病病毒GN0605株。 相似文献
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根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达. 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒豫北株的分离与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]分离与鉴定鸡传染性支气管炎病毒。[方法]从豫北某蛋鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集气管分泌物、肾脏等组织分离病毒,进行血凝试验、NDV干扰试验,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对HN07的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定。[结果]结果表明,分离到1株病毒,经连续鸡胚传代后,出现侏儒胚和蜷缩胚;血凝试验中,尿囊液无血凝性,而经胰酶处理后有血凝性;NDV干扰试验中,分离的尿囊液明显干扰NDV的增殖;病毒回归试验中病毒可引发接种鸡37.5%死亡;RT-PCR检测试验中,扩增到了约为1.7 kb的目的片段。DNAstar软件分析表明,测定基因具有IBVS1基因的共有分子特征,而且分离株HN07和HD株S1的同源性最高,核苷酸同源性为93.6%。[结论]分离的病毒株HN07为鸡传染性支气管炎病毒。 相似文献
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疑似猪流感(SIV)病猪的鼻拭子尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,72 h后致死鸡胚.取尿囊液进行血凝试验,分离物能使多种禽类和哺乳动物红细胞发生凝集;取尿囊液接种鸭胚、鹅胚,48 h后即致死鸭胚、鹅胚;取尿囊液接种鸡、鸭、鹅胚等成纤维原代细胞和Vero、PK、BHK、MA-104等传代细胞,发现病毒能使成纤维细胞、Vero出现变圆、皱缩、脱落等病变;尽管PK、BHK21、MA-104等细胞接种后不出现病变,但培养上清能凝集鸡红细胞;亚型鉴定该株病毒属猪流感病毒H1N1.进行病毒对BALB/C小鼠、信鸽、8周龄仔猪的回归试验,发现该株流感病毒能使信鸽和8周龄仔猪发病;BALB/C小鼠接种病毒后临床上不表现症状,但体内产生针对该病毒的抗体. 相似文献
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采集以腹泻、呼吸困难及主要症状的雏番鸭肝、脾病科，接种14d龄非免疫番鸭胚，80%胚在3～7d死亡，胚体呈弥漫性充血、出血。接种番鸭胚成纤维原代细胞72h可见细胞圆缩、聚团等变化。收集尿囊液及细胞培养物，以番鸭细小病毒（Muscovy duckling parvovirus,MDPV)阳性血清进行聚苯乙烯乳胶凝集，病料培养物均呈阳性反应，提取病料接种的尿囊液及细胞基因组DNA，用自行设计引物PCR扩增到与设计相符的600bp片段，经酶切鉴定，结果表明克隆到的片段为雏番鸭细小病毒特异性片段，从而初步证明分离到的病毒为雏番鸭细小病毒。 相似文献
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利用 PCR技术 ,从纯化番鸭细小病毒 M91 G2 7毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽 VP3基因。将该 PCR扩增片段克隆入 p UC1 8质粒载体的 H inc 和 Sac 位点之间 ,酶切分析筛选到含 1 .6kb基因片段的重组质粒 MP1 3。结果表明 :该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有 98.8%的同源性 ,氨基酸序列有 98.1 %的同源性 ,证明该重组质粒是 VP3基因的克隆。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒上海地方分离株的RT-PCR快速检测 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已报道的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)基因序列设计了 1对可用于扩增不同病毒株N基因片段的引物 ,得到了预期的 438bp长的产物 ,并将此RT PCR方法与鸡胚盲传法结合用于分离、检测IBV。分离病毒的扩增条带经纯化和回收以后 ,克隆到pMD18 T质粒载体中。在对插入片段进行序列测定后 ,我们将测序结果与已发表的IBVN基因序列进行了比较 ,证实具有极高的同源性 ,表明分离的是IBV。据此建立起一种更加快速、有效的分离、鉴定IBV的方法。 相似文献
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RT-PCR和Digoxigenin标记的核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒试验研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一ＩＢＶＨ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ，分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０ｂｐ，２２８ｂｐ，６０２ｂｐ，的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０，Ｈ５２，Ｍ４１，Ｃｏｎｎ，Ｇｒａｙ，Ｔ，Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒，上毒，云毒，ＨＫ，１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ。结果除Ｈｏｌｔｅ株，２个分离株（宜毒，云毒）外，其余均被成功地扩增出６０２ｂｐ的片段。将ＩＢＶＨ１２０株０６ｋｂＰＣＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记为探针，分别与上述各ＩＢＶ毒株的核酸及其扩增产物进行核酸杂交，均呈现阳性反应，而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＤＮＡ，ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液抽提物反应。ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交技术提供了直接从尿囊液中快速检测出病毒，作为诊断ＩＢＶ的新方法。 相似文献
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从德州市某些鸡场发生的以腺胃肿大为特征病变的病鸡群中收集腺胃组织进行了病原分离。分离病原通过SPF鸡胚传代可见典型的胚胎病变特征 ,电镜观察 ,可见到直径为 80～ 1 4 0nm、有囊膜及纤突呈冠状排列的病毒离子 ;经 1 %胰酶处理后能凝集鸡红细胞 ;接种 1 0日龄SPF雏鸡可引起与自然病例相似的病征及病理变化 ,并从病变组织中再分离到病毒 ,从而确定该分离株为鸡腺胃型传支病毒。用其制成的油乳剂灭活疫苗 ,可使接种鸡获得坚强的免疫力 ,能有效地预防本病的发生。 相似文献
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从发病鸡场中收集的腺胃肿大病料(编号为2/97、3/97和1/98),经匀浆和无菌处理后在SPF鸡胚中传代、分离和鉴定。结果显示,接种病料培养的鸡胚可干扰新城疫病毒的复制;这些分离毒株可与阳性标准参考株IBV抗血清反应,但表现出较低的中和反应能力。在理化和血凝特性等鉴定的基础上,参照已发表的IBV Beaudette毒株S1基因序列,设计并合成1对含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的特异性引物,利用RT-PCR技术扩增到分离毒株3/97、2/97、1/98长度为1.93kb的cDNA片段,并将其cDNA片段插入到克隆载体pBlueScript-SK(+)中,进行核苷酸序列的测定,确证所扩增和克隆的cDNA片段由1930个碱基组成,并编码1条由620个氨基酸组成的多肽。与GenBank中其它IBV S1基因序列进行比较,发现3/97、2/97和1/98毒株与所比较的IBV毒株核苷酸的一致性为73.6％～99.7％,氨基酸的一致性为78.4％～99.7％。 相似文献
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[目的]从发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,并对其进行鉴定。[方法]从安徽某鸡场发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用。通过动物回归试验,在SPF鸡上复制出支气管堵塞的症状,扩增分离毒株的S1基因片段,并与IBV疫苗毒株进行比较。[结果]对分离到的毒株进行HA检测,结果表明收获的尿囊液对鸡红细胞无凝集活性,说明分离到的病毒中无NDV、AIV等,但经1%胰酶处理则可凝集鸡红细胞,符合传染性支气管炎病毒的生物学特征。该毒株的第6代SPF鸡胚尿囊液通过滴鼻接种SPF鸡,可复制出与现场相似的临床症状,其发生了支气管堵塞的现象,初步证实分离的病毒为一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为XZ株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎的防治提供了理论依据。 相似文献
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新城疫F48E9病毒体外诱导的鸡T淋巴细胞程序性死亡 总被引：6，自引：1，他引：5
应用流式细胞仪及DNA琼脂糖凝胶电泳技术研究了我国鸡新城疫标准强毒F48E9株体外诱导鸡T淋巴细胞的程序性死亡现象。同时,对其灭活毒以及从该毒株提取的囊膜蛋白诱导鸡T淋巴细胞的程序性死亡现象进行了观察,并以健康SPF鸡胚尿囊液作为对照。结果发现,F48E9株及其灭活毒体外均可诱导鸡T淋巴细胞发生程序性死亡,而从病毒中提取的囊膜蛋白及SPF鸡胚尿囊液无此特性。新城疫F48E9株体外诱导鸡T淋巴细胞程序性死亡这一现象初步表明,新城疫强毒F48E9株感染鸡T淋巴细胞数量的减少和功能的降低以及由此所致的感染鸡免疫功能的降低可能和病毒诱导鸡T淋巴细胞发生程序性死亡有关。 相似文献
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探明鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV）感染鸡胚肾细胞（Chicken Embry-o Kidney Cells,CEK cell）,并且实现其增殖为目的。将IBV稀释液注射到SPF鸡胚尿囊腔内,培养鸡胚扩繁,观察记录结果;并培养CEK细胞,采用100倍半数组织培养感染量的IBV进行染毒实验;应用Reed-Muench法计算半数鸡胚感染量为10-6.68/0.1 mL;用Real time PCR检测IBV在感染细胞中的含量,以确定IBV在CEKcells中已经感染且增殖成功。结果表明,接种10日龄的SPF鸡胚可以收集更多的、约8 mL的尿囊液毒;反复盲传至7代的IBV可使CEK cells产生明显的细胞病变效应;通过实时荧光定量PCR和RT-PCR检测,最终确定IBV-M41型扩繁成功并且能够在CEK细胞上繁殖,为下一步实验提供了参考。 相似文献
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单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒 总被引：3，自引：0，他引：3
用SPF鸡胚将送检的免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代，再用新城疫单抗夹心ELISA对F1代尿囊液进行新城疫病毒(NDV)快速检测，同时用世界动物卫生组织(OIE)推荐的NDV分离及鉴定的方法加以验证。通过对3423份样品的检测，检出阳性样品453份，阴性样品2959份，可疑样品11份，两种方法的阳性符合率为99．3％，阴性符合率为99．7％。对全部阳性样品进行病毒分离，经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验证明均含有新城疫病毒(NDV)，再将全部阳性样品分离物进一步作毒力鉴定，结果有强毒力株、中等毒力株及弱毒力株，因此用新城疫单抗夹心ELISA检测免疫鸡群泄殖腔棉拭样品F1代尿囊液新城疫病毒快速、准确率高，呈阳性者不全是NDV强毒力株感染，还有NDV中等毒力株或弱毒力株感染。 相似文献
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以传染性法氏囊病毒强毒株接种９日龄鸡胚尿囊腔，待鸡胚死亡后，收集其尿囊液，提取病毒。纯化的病毒ＲＮＡ在３％琼脂糖凝胶电泳上呈现出２９０ｂｐ和３４００ｂｐ的两条带。收集这两条带，以病毒全基因组制备生物素标记的探针。此探针有良好的特异性。它不与其它３种禽类病毒（ＮＤＶ，ＩＢＶ，ＩＬＶ）的核酸抽提物发生交叉反应。此试验是快速、敏感、可重复的。其敏感度达０．５ｐｇ。 相似文献