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[目的]建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持.[方法]根据GenBank已发表NDV的F基因序列(GenBank登录号JX840454)和APV的F基因序列(GeneBank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性.[结果]优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(LaSota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现.二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA.应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致.随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(GenBank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(GenBank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%.[结论]针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持. 相似文献
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单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒 总被引：3，自引：0，他引：3
用SPF鸡胚将送检的免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代，再用新城疫单抗夹心ELISA对F1代尿囊液进行新城疫病毒(NDV)快速检测，同时用世界动物卫生组织(OIE)推荐的NDV分离及鉴定的方法加以验证。通过对3423份样品的检测，检出阳性样品453份，阴性样品2959份，可疑样品11份，两种方法的阳性符合率为99．3％，阴性符合率为99．7％。对全部阳性样品进行病毒分离，经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验证明均含有新城疫病毒(NDV)，再将全部阳性样品分离物进一步作毒力鉴定，结果有强毒力株、中等毒力株及弱毒力株，因此用新城疫单抗夹心ELISA检测免疫鸡群泄殖腔棉拭样品F1代尿囊液新城疫病毒快速、准确率高，呈阳性者不全是NDV强毒力株感染，还有NDV中等毒力株或弱毒力株感染。 相似文献
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根据已报道的鸡减蛋综合征(Egg drop syndrome 1976 EDS-76)病毒DNA序列,设计合成了1对能扩增300 bp DNA片段的引物,建立了EDS-76病毒的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法。该方法对EDS-76病毒标准株AV-127扩增结果为阳性;对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)和鸡新城疫病毒(NDV)的扩增结果均为阴性。结果表明该方法特异且敏感,检测的最低病毒DNA含量达到2.5×10-2pg,PCR检测表明,从试验感染鸡的心脏中不能检测出病毒,肝脏和肾脏只有在感染后7~15 d检出,在试验感染后4~21 d的子宫、血液和4~17 d的脾中均能检测到病毒。 相似文献
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辛朝安 《华南农业大学学报》1983,(2)
本试验利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在鸡胚内对B_1株新城疫病毒(NDV—B_1)的干扰现象作为鸡传染性支气管炎(IB)的一种诊断方法。对其特异性、敏感性、操作方法以及对天然病例的诊断效果等几个方面的问题进行了探讨。 用IBV强毒人工发病的病鸡组织上清液接种鸡胚后10小时,再接入一定量的NDV—B_1,则50％以上鸡胚的尿囊液的HA滴度在1:20以下,而仅接NDV—B_1的对照组中,90％以上鸡胚的尿囊液的HA滴度在1:40或1:40以上,说明IBV在鸡胚内明显地干扰了NDV—B_1,在IBV被相应的抗血清中和之后,这种干扰作用也随之消失。 新城疫病毒(NDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)、鸡败血霉形体(MG)等鸡呼吸道病的病原在鸡胚内对NDV—B_1则没有这种干扰现象。 利用这种干扰现象对6个鸡场的呼吸道病的病例进行诊断试验,结果4个鸡场为IB阳性,2个鸡场为IB阴性,这一结果与用病料在鸡胚内进行盲传继代及小鸡人工发病的结果是相符的。 试验证明,IBV在鸡胚内对NDV—B_1的干扰试验可以作为IB的一种诊断方法。 相似文献
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【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5μL,NDV的上、下游引物各1.0μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0μL,Premix Taq~(TM)12.5μL,无RNase水补足至25.0μL。最佳扩增程序:95.0℃预变性5 min;94.0℃1 min,58.5℃1 min,72.0℃1 min,进行35个循环;72.0℃延伸10 min,12.0℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。 相似文献
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用AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id两株新城疫病毒(NDV)的抗独特型单抗(MAb_2)分别免疫接种一组(18只)无HI抗体鸡,并以一组(7只)Lasota苗常规免疫鸡和一组(12只)不免疫的易感鸡分别作为免疫阳性和阴性对照。在两株MAb_2末次免疫后8天,用微量血凝抑制(HI)试验检测了4组鸡的血清中HI抗体水平。结果:两株MAb_2和Lasota苗免疫的鸡全都产生了HI抗体,非免疫鸡均未测到HI抗体。AFE_8Id_(16-6)免疫鸡的HI滴度为1～5log_2;ALA_(15-6)Id免疫鸡的HI滴度为1～4log_2;Lasota苗免疫鸡的HI滴度高达7～10log_2。在HI抗体检测后2天,用100LD_(50)F_(48)E_8株NDV强毒攻击4组鸡,隔离观察10天,AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id免疫鸡的保护比值分别为17/18和10/18,Lasota苗免疫鸡保护比值达7/7,而非免疫对照鸡在攻毒后6天全部死亡。试验结果证明,上述两株MAb_2是NDV保护性抗原的模拟物,在多次注射后可诱导鸡产生抗NDV的血凝抑制抗体,并能使鸡抵抗NDV强毒的人工感染。因此,这两株抗独特型单抗,尤其AFE_8Id_(16-6)有希望用作新城疫抗独特型疫苗。 相似文献
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用单抗夹心ELISA快速检测鸡新城疫病毒 总被引：3，自引：0，他引：3
采用传统的病毒分离的方法将免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代，再用新城疫单抗夹心ELISA对F1尿囊液进行新城疫病毒(NDV)检测。结果表明本方法具有良好的特异性，NDV阳性样品检出率很高，且鸡禽流感病毒(AIV)对此无干扰作用；分别检测阳性样品453份、阴性样品2959份，与动物世界卫生组织(OIE)推荐的病毒分离及鉴定、毒力试验的经典检测方法相比较，符合率为99．3％、99．7％；测定的变异系数为8％，稳定性较好，同时本法比经典的检测方法缩短检测时间7d。结果表明用单抗夹心ELISA法检测鸡泄殖腔棉拭样品F1尿囊液新城疫病毒实用、准确、特异、稳定、快速。 相似文献
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应用酶联免疫吸附试验检测鸭瘟病毒的实验研究 总被引：7，自引：0，他引：7
用酶联免疫吸附试验检测77例雏鸭,30例成年鸭人工感染鸭瘟病毒后病料中的抗原,能在临床症状出现之前从肝脏、脾脏、粪便和血液中检出病毒,达到早期诊断的目的。用本法检测了鸭瘟病毒在四种病科中的出现情况,找出了临床采样检测的最佳部位和时间。该方法具有特异性(不与NDV毒株,DPV弱毒株及巴氏杆菌发生交叉反应)、敏感性(雏鸭最高检出率可达94.6％,成年鸭最高检出率可达100％)可行性(样品易保存、结果易观察、试剂设备简单)、快速性(一天能得出结果)。可用于现场诊断及检疫。比目前常用于诊断鸭瘟的方法更具有实用和推广价值。 相似文献
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《农业科学学报》2017,(4)
Citrus yellow vein clearing virus(CYVCV) is considered as the causal agent of Citrus yellow vein clearing disease and belongs to the genus Mandarivirus in the family Alphaflexiviridae.Capsid protein(CP) of CYVCV Chongqing isolate(CYVCVCQ) was produced using a prokaryotic expression system and used as the immunogen for monoclonal antibody(MAb)production.Four highly specific and sensitive murine MAbs and one polyclonal antibody were prepared in this study.Titers of the four MAbs in ascites fluids ranged from 10~(-6) to 10~(-7) as determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Three serological assays,including dot enzyme-linked immunosorbent assay(dot-ELISA),tissue blot-ELISA,and double-antibody sandwich(DAS)-ELISA,were developed for quick and reliable detections of CYVCV in citrus samples.The developed dot-ELISA and DAS-ELISA methods could detect CYVCV in the infected citrus leaf crude extracts diluted at 1:2560and 1:10240(w/v,g mL~(-1)),respectively.The detection result of 125 citrus leaf samples collected from citrus groves in Yunnan Province and Chongqing Municipality of China showed that approximately 36%samples were positive for CYVCV.This virus was,however,not detected in any sample collected from Zhejiang or Jiangxi Province,China. 相似文献
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王长杰 《金陵科技学院学报》1995,(4)
用新城疫(ND)单抗酶联试剂盒检测从疑有新城疫病毒强毒感染的鸡群中采集泄殖腔棉拭样品68份,检出阳性20份。随机对其中15份样品进行病毒分离,结果阳性符合率为100％(15/15)。结果表明,该试剂盒特异性强,灵敏度高,诊断快速,易于基层推广应用。为ND的确诊和免疫鸡群中NDV强毒感染的监测提供了新方法。 相似文献
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【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVYN及PVYO样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。 相似文献
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根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。 相似文献
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将复性的重组NDV HN蛋白免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤.通过ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗HN单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞4E11.ELISA和Western-blot结果表明,该MAb能与NDV特异性反应,而不与H9亚型AIV,IBDV,EDS76,IBV和CIAV交叉... 相似文献
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Based on the antigenic analysis of Reticuloendotheliosis virus （REV） envelop glycoprotein （env） protein, an alternative indirect enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for detection of REV antibody was developed using a truncated env protein of REV produced in Escherichia coli. This assay was validated by comparison with an indirect immunofluorescence assay （IFA） and a REV-based ELISA. The diagnostic sensitivity （DSN）, specificity （DSP） and accuracy of the env indirect-ELISA （ienv-ELISA） were 93.7, 93.3 and 93.6% compared with IFA on 1 380 field serum samples, and 84.8, 95.2 and 91.7% compared with the REV-based ELISA on 96 field sera, respectively. Cross-reactivity assay showed that this assay was REV-specific. Repeatability test revealed that the coefficients of variation of positive sera within and between runs were less than 15%. This method is simpler to produce and perform, time-saving and suitable for large scale survey of REV antibody at low cost. 相似文献
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ＳＰＦ试验鸡在８、２５日龄时接受了２次新城疫（ＮＤ）基础免疫，６０日龄时分别以标准新城疫病毒（ＮＤＶ）强毒株、中等毒力和弱毒疫苗株人工感染攻毒。应用单抗ＥＬＩＳＡ试剂盒，对所有试验鸡泄殖腔棉拭样品进行了３０ｄ的连续检测。结果表明：从攻毒后第３ｄ起强毒株试验组检测出多例阳性，检出高峰分别在攻毒后第４～６ｄ和１１～１５ｄ，与鸡群症状表现的时间相一致；中等毒力和弱毒疫苗株对照组均呈检测阴性。本研究证明单抗ＥＬＩＳＡ试剂盒可以检测免疫鸡群中ＮＤＶ强毒感染，为ＮＤ的监测提供了新手段。 相似文献