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丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL-1,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL-1）。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。 相似文献
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[目的]用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考.[方法]用DNaseI消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组.通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列.[结果]经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88‰98％,确定为里氏木霉cbh1的基因片段.经DNaseI消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因.将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库.从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1.序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置.[结论]改造后的cbhl因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力. 相似文献
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目前饲料工业中所使用的纤维素酶和葡萄糖氧化酶来自不同的表达系统,其生产成本较高;而在同一种微生物宿主中同时表达这两种重要的饲料工业用酶则有可能会降低成本。根据里氏木霉中密码子的偏好性优化黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因god,并利用DNA assembler方法构建pRS424-cbh1P-god-cbh1T质粒(p PGT质粒);通过PEG介导的原生质体转化法,将其转入里氏木霉Tu-6Δtku70尿嘧啶缺陷型菌株中,经筛选得到葡萄糖氧化酶酶活较高的一株转化子(2号),SDS-PAGE分析显示重组GOD的蛋白分子量大小约为70 k Da,进一步使用质谱确证了GOD得到成功表达。摇瓶发酵表明,2号转化子在微晶纤维素诱导92 h后,GOD酶活达到4.63 U/m L。该转化子的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和外切纤维素酶活分别为7.88 U/m L、2.58U/m L和0.84 U/m L,而出发菌株分别为6.79 U/m L、3.19 U/m L和0.57 U/m L,而β-葡萄糖苷酶由原来的0.66U/m L提高到1.65 U/m L(1.5倍)。实验表明,在里氏木霉中表达GOD能显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活,也能使总体纤维素酶活得到提高。 相似文献
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【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。 相似文献
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比较了不同发酵条件对里氏木霉产β-葡聚糖酶和木聚糖酶性能的影响.结果表明,里氏木霉产两种酶的最佳碳源和氮源各异,其中木霉产木聚糖酶的最佳碳源为乳糖,氮源为牛肉膏;而产β-葡聚糖酶的最佳碳源为麸皮,氮源为硫酸铵. 在培养条件方面,里氏木霉产木聚糖酶和β-葡聚糖酶的最适起始pH值分别是4.0和5.0,最适发酵温度均为30 ℃.研究还表明吐温20、吐温80和甜菜碱等3种表面活性剂均具有促进木霉产酶作用,其中甜菜碱对产木聚糖酶的效果较好,而吐温20对产β-葡聚糖酶效果较佳.就产酶进程而言,木霉在培养20 h之后开始产木聚糖酶,而产β-葡聚糖酶比产木聚糖酶滞后约4 h,它们分别在48 h和44 h时产酶量达到高峰. 相似文献
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《江苏农业科学》2018,(21)
在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中,降解纤维素为葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的活性及其表达时起到至关重要的双重作用。为了研究β-葡萄糖苷酶Cel1a在里氏木霉Rut C-30中对纤维素酶诱导表达及其酶活性的影响,以里氏木霉的基因组DNA为模板,设计扩增看家基因(β-actin)的启动子(Pact)和cel1a的引物,分别进行Pact、cel1a的PCR扩增,然后利用重叠PCR将Pact、cel1a连成1个片段Pact-cel1a,再通过酶切成功地将Pact-cel1a片段连接到p CAMBIA1300二元质粒上,从而为后续研究β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活性及其表达过程中的作用奠定了基础。 相似文献
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绿色木霉(Trichoderma viride)所产生纤维素酶可将秸秆天然纤维素组分转化为可发酵的糖,不仅对废物进行再利用,还可以减少环境污染.以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106总RNA为模板,利用RT-PCR技术反转录合成外切葡聚糖水解酶(CBHI)基因约1545bp的cDNA片段.该序列与GenBank中的cbhI E00389序列比较,氨基酸序列同源性达91％.大肠杆菌BL21原核表达和SDS-PAGE结果表明,重组蛋白分子量约为53kDa,重组酶活力为5.3U· mg-1. 相似文献
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采用基因敲除技术,在工业酿酒酵母染色体DNA上的甘油代谢途径关键酶基因GD P 1中,整合入来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因bgⅡl,通过提高G 418浓度筛选得到多拷贝整合子。结果表明,整合子利用纤维二糖的能力得到提高,产甘油能力下降,外源基因表达稳定;引入外源基因后,其对酵母增殖能力没有大的影响,仅形态发生变化;在以微晶纤维素为原料,结合纤维素酶发酵时,与亲代工业酿酒酵母相比,发酵液乙醇浓度最高增加69%。 相似文献
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低温木质纤维素分解复合菌系PLC-8对玉米秸秆的分解特性 总被引：1，自引：0，他引：1
为提高东北寒区玉米秸秆的分解效率,突破低温的瓶颈,探讨了低温木质纤维素分解复合菌系PLC-8对玉米秸秆的分解效果及其微生物多样性。通过pH、玉米秸秆的减重、木质纤维素的含量、酶活性、有机酸含量等指标评价玉米秸秆的分解效果,采用变性凝胶电泳（DGGE）和高通量测序技术研究其微生物多样性。结果表明：pH先下降后回升至接近初始值;30 d后,玉米秸秆减重率达到43.65%;半纤维素、纤维素、木质素含量分别减少了61.13%、40.91%、14.25%;纤维素酶活性先升高后降低,其中滤纸酶和β-葡萄糖苷酶活性在第20 d,分别为0.054、0.025 U·mL-1;内切酶和外切酶活性的最高值在第15 d,分别为0.032、0.030 U·mL-1;木聚糖酶活性随着玉米秸秆的分解而逐渐升高,甲酸和乙酸分别在第20和15 d达到最高值。微生物群落分析表明,PLC-8由细菌和真菌组成,具有分解稳定性,在属的水平上细菌优势菌株为金黄杆菌属（Chryseobacterium）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）等,真菌的优势菌株为肉座菌（Hypocreales）。 相似文献
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[目的]构建里氏木霉外源表达载体。[方法]以里氏木霉40359的CBHI启动子和终止子构建了里氏木霉40359外源表达载体,并用该表达载体成功表达了抗潮霉素B磷酸转移酶基因,得到6株可在含175mg/L潮霉素的基础培养基上生长的抗性菌株;提取6株抗性菌株的DNA整合到里氏木霉菌株中,并对其进行潮霉素耐受性检测。[结果]6株抗性菌株的抗潮霉素能力比原始菌株提高了75%;转基因菌株的潮霉素抗性可以稳定遗传,证明表达载体构建成功。[结论]为开展里氏木霉分子生物学研究与遗传改造奠定了基础。 相似文献
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[目的]优化里氏木霉RutC-30产纤维素酶的液体发酵条件。[方法]以里氏木霉RutC-30为出发菌株,通过单因素试验研究培养基不同氮源(硫酸铵、尿素、蛋白胨)及浓度、不同碳源(纤维素、乳糖、甘油、葡萄糖)及浓度和不同的初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)对产酶的影响,在此基础上选取氮源、碳源和pH为影响因子采用正交试验探讨里氏木霉RutC-30产纤维素酶的优化条件。[结果]正交试验分析表明,各因素对产酶影响顺序依次为碳源>氮源>pH,里氏木霉RutC-30产纤维素酶的最佳条件是:以1%纤维素为碳源、以0.5%蛋白胨为氮源,初始pH值为4.0,在30℃产酶发酵培养5 d,纤维素酶活力高达7.303 U。[结论]里氏木霉RutC-30经优化培养后,产酶能力可得到大幅度提高,具有潜在的工业应用价值。 相似文献
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[目的]构建里氏木霉外源表达载体。[方法]以里氏木霉40359的CBHI启动子和终止子构建了里氏木霉40359外源表达载体,并用该表达载体成功表达了抗潮霉素B磷酸转移酶基因,得到6株可在含175 mg/L潮霉素的基础培养基上生长的抗性菌株;提取6株抗性菌株的DNA整合到里氏木霉菌株中,并对其进行潮霉素耐受性检测。[结果]6株抗性菌株的抗潮霉素能力比原始菌株提高了75%;转基因菌株的潮霉素抗性可以稳定遗传,证明表达载体构建成功。[结论]为开展里氏木霉分子生物学研究与遗传改造奠定了基础。 相似文献
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酸性海藻糖酶作为生物催化剂在生物工业中广泛应用，挖掘酶学性质优良的酸性海藻糖基因具有重要意义。从Bispora sp. MEY-1中成功克隆出一个酸性海藻糖酶基因TreA，并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对纯化后的酸性海藻糖酶TreA进行酶学性质鉴定，其最适pH为4.0，在pH 2.2~5.0范围内，该酶能够维持60%以上的酶活力。TreA在偏酸条件下稳定效果比较好，在pH 1.0~4.0条件下处理1 h，可以剩余88%以上的酶活力。TreA的最适温度为60 ℃，在40~70 ℃之间都可以维持50%以上的酶活力，属于中高温酶。重组海藻糖酶TreA的比活为1 913 U·mg-1，动力学参数Km和Vmax分别为0.67 mg·mL-1和119 μmol·min-1·mg-1。同时，还评估了不同金属离子或化学试剂对纯海藻糖酶TreA的酶活性影响及其蛋白酶抗性。极大丰富了海藻糖酶基因资源，促进了其在生物工业中的应用。 相似文献
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Selection of Trichoderma mutants with enhanced cellulase production and resistant to catabolite repression 
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下载免费PDF全文 Szakacs G Megyeri L Kovacs K Zacchi G 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2004,30(4):433-433
Due to high cost and relatively low efficiency of cellulase enzymes used for the saccharification of pretreated lignocelluloses, the improvement of cellulase secreting microorganisms is of vital importance. Trichoderma reesei QM 6a, an excellent source of cellulase was selected in the late 1960's. at Natick Laboratories by its performance on pure cellulose (Solka Floc, Avicel) . QM 6a is the wild parent strain of best existing hypercellulolytic mutants such as Rut C30, VTT-D-80133, L… 相似文献
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[目的]构建刺激植物响应蛋白Epll基因的真核表达载体,筛选多拷贝酵母转化子.[方法]以深绿木霉（Trichoderma atroviride）ACCC30153的cDNA为模板进行PCR获得Epl1基因片段,并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置,获得重组表达载体,并将pPIC9K-Epl1转入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,并用不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株.[结果]对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性;在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子GS115-Epl1,经PCR鉴定1株转化子呈阳性.[结论]Epl1基因的我体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础. 相似文献
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为探究不同浓度纳米银和纳米氧化铁溶液对甜瓜抗白粉病的影响及其作用机理，于4叶1心期对甜瓜植株喷施纳米银（T1处理）、纳米氧化铁（T2处理）溶液及清水（CK），对薄皮甜瓜幼苗叶片病情指数及过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（hydrogen peroxidase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量进行测定。结果表明，与对照相比，喷施纳米银和纳米氧化铁可显著提高薄皮甜瓜抗白粉病的能力，显著降低叶片病情指数，其中，T1-4和T2-4处理（10.00 μmol·mL-1）病情指数比对照分别减少32.52%和34.96%。T1和T2处理均提高了叶片中POD和SOD活性，在病原菌接种后不同处理时间，T1和T2处理中POD活性呈现先升高后降低的趋势，最高值均出现在接种后72 h，其中，接种72 h后T1-3处理（5.00 μmol·mL-1）POD活性较对照高56.6%，T2-4处理（10.00 μmol·mL-1）比对照高61.1%。T1处理中SOD活性先升高，在72 h达到峰值后降低，T1-3处理（5.00 μmol·mL-1）接种72 h后出现最大值，为376.0 U·g-1 FW；T2处理中SOD活性呈现逐渐升高的特点，T2-4处理（10.00 μmol·mL-1）接种96 h后较对照高85.6%。与对照相比，T1和T2处理叶片CAT活性呈现不一致的变化趋势。与对照相比，T1处理MDA含量较低，整体呈现先升高后降低的趋势，T1-3处理（5.00 μmol·mL-1）48 h MDA含量较对照降低15.8%；T2处理中MDA含量除处理72 h低于对照组，其余均显著高于对照组，T2-1（1.25 μmol·mL-1）处理24 h后MDA含量较对照组升高41.5%。综上所述，纳米银和纳米氧化铁处理对甜瓜白粉病具有一定的防治效果，研究结果为纳米银和纳米氧化铁对甜瓜白粉病防治提供了理论依据。 相似文献