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1.
鲮(Cirrhinus molitorella)是华南地区重要的淡水养殖品种之一,但是鲮生长速度慢,且不耐低温,是目前鲮养殖产业所面临的主要问题。作为利用转基因技术培育快速生长鲮新品系研究工作的一部分,本实验利用PCR和一种新的染色体步移方法克隆了鲮β-肌动蛋白(β-actin)基因启动子和全基因组DNA序列。鲮β-actin基因长4 351 bp,由6个外显子和5个内含子组成。鲮β-actin基因启动子区域包含1个TATA盒,1个CCAAT盒,2个CArG调控元件和1个CRE调控元件,并且鲮β-actin基因内含子1中也含有一个CArG调控元件。这些结构特征说明本研究所克隆的鲮β-actin基因序列具有典型的启动子特征。鲮β-actin基因启动子的克隆为转基因鲮表达载体的构建提供了一个重要的调控结构元件。 相似文献
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为获得快速生长的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus),研究了泥鳅β-actin基因启动子介导的革胡子鲶(Clarias gariepinus)生长激素(growth hormone,GH)重组基因。采用PCR和RT-PCR技术克隆泥鳅β-actin基因近端启动子、3′-UTR及革胡子鲶GH基因编码区,构建一个长为2 418bp的GH重组基因DPRK。首先,构建了以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因的重组表达载体p AF(pβ-actin promoter-EGFP),然后转染DF1真核细胞,同时经酶切线性化后显微注射到斑马鱼(Danio rerio)和泥鳅的受精卵中,以评价泥鳅β-actin启动子的启动活性。其次,将重组基因DPRK显微注射到泥鳅受精卵中。结果显示:泥鳅β-actin启动子能在DF1细胞、斑马鱼和泥鳅的受精卵中启动绿色荧光蛋白的表达;泥鳅的荧光表达率(78.44%)显著高于斑马鱼(29.62%);泥鳅受精卵显微注射DPRK 20d后,在m RNA水平检测到GH基因的表达。这表明泥鳅β-actin基因近端启动子具有显著的启动活性,且重组基因DPRK能在泥鳅体内表达,为下一步泥鳅的基因工程育种奠定了理论基础。 相似文献
3.
稀有鮈鲫是一种新型的模式实验鱼,具有利用转基因技术培育开发成为观赏性鱼类的潜在可能。本实验采用PCR方法,从稀有鮈鲫基因组DNA中分离得到大小为1584bp的β肌动蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明,该片段包括长为1507bp的启动调控区和77bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为109bpβ-actin基因上游调控序列,不翻译的外显子1和内含子1。上游调控序列中含有TATAbox,CAATbox和CArGbox等与转录活性密切相关的作用元件,并且在稀有鮈鲫β-actin基因第一个内含子中也含有1个CArG调控元件。将该启动子片段克隆到绿色荧光表达载体(pAcGFP1-1)上,显微注射入稀有鮈鲫的受精卵中,通过荧光显微镜能观察到绿色荧光蛋白的表达。本实验成功分离了具有驱动活性的稀有鮈鲫β-actin基因启动子。 相似文献
4.
《渔业科学进展》2010,(2)
稀有鮈鲫是一种新型的模式实验鱼,具有利用转基因技术培育开发成为观赏性鱼类的潜在可能。本实验采用PCR方法,从稀有鮈鲫基因组DNA中分离得到大小为1584bp的β肌动蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明,该片段包括长为1507bp的启动调控区和77bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为109bpβ-actin基因上游调控序列,不翻译的外显子1和内含子1。上游调控序列中含有TATAbox,CAATbox和CArGbox等与转录活性密切相关的作用元件,并且在稀有鮈鲫β-actin基因第一个内含子中也含有1个CArG调控元件。将该启动子片段克隆到绿色荧光表达载体(pAcGFP1-1)上,显微注射入稀有鮈鲫的受精卵中,通过荧光显微镜能观察到绿色荧光蛋白的表达。本实验成功分离了具有驱动活性的稀有鮈鲫β-actin基因启动子。 相似文献
5.
利用PCR技术克隆唐鱼（Tanichthys albonubes）β-actin基因。所克隆的β-aetin基因片段为1464bp，包含长为1374bp的启动调控区和90bp的部分开放阅读框。启动调控区包括105bp的β-actin基因上游调控序列、第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT Box、TATA Box、CArG Box等元件。将唐鱼β-actin启动调控区克隆到红色荧光表达载体pDsRed2-1上，并显微注射到唐鱼受精卵中，荧光显微镜观察红色荧光蛋白（RFP）的表达。结果表明，RFP在转基因唐鱼中的表达阳性率较高，最高可达51．8％，且RFP的表达水平较高。PCR检测转基因唐鱼的部分器官组织，在被检组织器官中均能检测到外源RFP基因；而RT-PCR以及Southern blot验证显示RFP mRNA的表达有所不同；Southern blot检测肌肉组织基因组DNA，可见比阳性载体大的杂交条带。说明所检测的组织中已发生外源基因RFP的整合，但有些组织存在表达水平较低或者不表达的现象。本实验分离到的β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能，可启动外源基因在唐鱼体内的高效表达，从而为下一步进行功能基因的转化研究奠定基础。 相似文献
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目的为了建立检测绵羊整联蛋白受体αv亚基基因(ITGAV)mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,构建目的基因ITGAV、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线。方法根据GeneBank中绵羊ITGAV和β-actin基因编码区保守序列,设计特异引物,选择绵羊卵巢组织cDNA为模板进行PCR扩增,产物回收纯化后,与PMD18-T载体连接、转化感受态DH5α,筛选白色菌落并摇菌培养,经PCR和测序鉴定获得阳性ITGAV、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒107～102梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果ITGAV基因相关系数(RSq)=0.998,扩增效率(Eff.)=104.7%;β-actin基因相关系数(RSq)=0.998,扩增效率(Eff.)=111.6%。经熔解曲线分析,ITGAV基因熔解温度为84.66℃,β-actin为86.92℃,2个基因片段的熔解曲线均呈单峰,扩增曲线呈典型的S型动力学曲线,指数扩增期和平台期十分明显,表现为理想的扩增曲线。结论成功构建目的基因ITGAV、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线。 相似文献
7.
草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估 总被引：2，自引：0，他引：2
为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。 相似文献
8.
为了探讨piggyBac转座子在鲤科鱼类及鳅科鱼类转基因中的适用性,实验通过将PAβ启动子控制的DsRed表达元件插入pigA3GFP中,构建转基因载体pigA3GFP-AβDsRed。用该载体对草鱼肾脏(CIK)细胞转染,结果显示,通过piggyBac转座子可将外源基因导入到CIK细胞的基因组中,来源于家蚕的A3启动子和来源于巨细胞病毒的CMV启动子在CIK细胞均具有活性。将转基因载体pigA3GFP、pigA3GFP-AβDsRed分别与辅助质粒helper-pigA3混合后以精子介导法导入金鱼和泥鳅的受精卵后,经荧光观察、PCR鉴定、Dot blotting鉴定,证实获得了转基因金鱼和转基因泥鳅。研究表明,PB转座子在鲤科鱼类及鳅科的一些鱼中具有转座活性。 相似文献
9.
β-actin是actin家族的一员，在维持细胞结构、细胞内运动和细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的鲮（Cirrhinus molitorella）β-aetin基因的cDNA全长1 804bp，开放阅读框长1 128bp，编码375个氨基酸，5’和3’末端非翻译区域（UTR）分别为94bp和582bp。RT-PCR结果表明，β-actin在未经LPS刺激的和经LPS刺激的鲮心脏、肾脏、肌肉、肝脏、脾脏、肠、脑和皮肤等8种组织中广谱表达，表达水平没有明显差异，可以作为基因表达调控研究的分子内标。鲮与其他鱼类β-actin基因编码区核苷酸序列同源性在85.9％～99.6％。分子系统进化树分析表明，可将鱼类分成鲤形目，鲈形目，鲑形目和合鳃目4大支，与传统分类一致，β-actin基因核苷酸序列是研究分子进化的一个很好的分子标记。 相似文献
10.
FcβGBP-HDL是中国明对虾免疫应答中的一种模式识别受体,在白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)侵染后其表达显著上调.为了探讨FcβGBP-HDL在免疫应答中的转录调节机制,实验以FcβGBP-HDL cDNA为基础设计引物,采用染色体步移技术对其基因组DNA和启动子进行克隆,构建一系列缺失表达载体进行启动子活性分析.结果显示,FcβGBP-HDL基因全长6 713 bp,无内含子;启动子区域长1 507 bp,除了1个启动子核心序列、2个SRF、2个TBP、1个CTF和1个CRE等典型的启动子特征外,还有2个GATA-1、3个AP-1、1个c-Ets-1和7个Sp1等参与其它节肢动物免疫基因转录调节的结合位点;同源比对分析表明,FcβGBP-HDL启动子与FcCTL启动子相似度最高(41.4％);不同长度的启动子片段具有不同的启动荧光素酶报告基因表达的活性,其中去除5 '端2个AP-1后的启动子片段具有最高的启动活性,去除启动子核心序列的启动子片段启动活性最低.研究表明,FcβGBP-HDL启动子可能在免疫反应中受到调节. 相似文献
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脊椎动物中不同物种的β-actin基因氨基酸之间的序列同源性超过98%。根据GenBank中登录的大菱鲆β-actin基因mRNA部分序列,与川鲽该基因全编码区DNA序列比对,依据比对结果分别在大菱鲆β-actin基因相邻外显子上设计1对引物,分别以RNA反转录产物和DNA为模板通过PCR方法进行克隆分析。对不同退火温度和循环数条件下的该基因RT-PCR产物进行了对比。针对RNA提取过程中的经过DNase处理但很难除净的痕量DNA污染,在琼脂糖凝胶电泳中很难被检测到的问题,初步探讨了利用上述2种模板对该基因扩增片断大小的不同来检出痕量DNA污染的可行性。 相似文献
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为获得能在肌肉表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼(Brachydaniorerio),采用PCR方法,从斑马鱼基因组DNA中分离了肌球蛋白轻链2启动子,序列分析表明,该启动子与国外文献报道的斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子序列的相似性为98.6%。将改造后的启动子插入绿色荧光蛋白基因载体,构建成肌肉特异性表达载体。通过显微注射,将线性化的表达载体注入斑马鱼的受精卵,获得了转绿色荧光蛋白基因的斑马鱼。绿色荧光蛋白在胚胎期开始表达,随着鱼体的生长表达量有增加的趋势,成鱼在紫外灯下用肉眼即可观察到绿色荧光。转基因鱼绿色荧光蛋白的表达具有明显的肌肉特异性。本研究为下一步特定基因的表达研究和获得有特色的转基因观赏鱼奠定了基础。 相似文献
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内参基因在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中具有校准的作用,然而鲤疱疹病毒Ⅱ型感染异育银鲫内参基因目前仍未见研究报道。采用qRT-PCR技术检测不同处理条件下异育银鲫组织和尾鳍细胞GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4个候选内参基因在组织和尾鳍细胞的转录水平,利用软件geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct分析了其表达量的稳定性,以筛选出健康异育银鲫不同组织以及鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的肾脏、脾脏和异育银鲫尾鳍细胞在不同时间均较稳定的内参基因。geNorm稳定值以及4个内参的表达量Ct值分析显示,健康异育银鲫脑、脾脏、肾脏、肌肉、鳃、肠、肝脏和心脏组织中β-actin和EF-1α都是比较稳定的内参基因;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染肾脏和尾鳍细胞不同时间点,内参基因β-actin稳定性最佳;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染脾脏不同时间点时,EF-1α稳定性最佳。分别以4个候选内参基因为内参分析PIN1基因在肾脏组织不同感染时间的相对表达量,结果进一步证实,PIN1基因在肾脏组织感染不同时间点以β-actin为内参时,其表达量呈下降趋势,与cDNA文库测序中的表达量分析结果一致,各时间点的表达量差异极显著(P<0.01)。本试验结果有利于研究异育银鲫在不同处理条件下基因的表达分析,可为获得精准的结果奠定理论基础。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果 总被引：1，自引：1，他引：0
将草鱼呼肠孤病毒( GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71 -VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果.重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30 μg空载体组及对照组.于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果.结果显示,pFastBac-β-VP71 -VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录;各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第21天达到最高,攻毒后10、30、60 μg核酸疫苗免疫组死亡率分别为0％、0％、5％,而空载体组和对照组分别为30％和100％,表明pFastBac-β-VP71-VP72作为核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果.研究结果为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础. 相似文献
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以合浦珠母贝（Pinctada fucata）为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin）和18S核糖体rRNA（18S rRNA）3个管家基因在合浦珠母贝不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期mRNA水平的表达情况。同时比较了BestKeeper、geNorm和NormFinde软件对试验数据处理的差异,从中选出合适的内参基因。结果表明β-actin在不同组织和胚胎发育不同阶段表达最稳定,18S rRNA在性腺发育不同时期表达最稳定。 相似文献
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为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。 相似文献
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根据黄鳍鲷白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)基因全长cDNA序列(GenBank登录号为AY669059)设计、合成1对特异性引物,扩增编码黄鳍鲷IL-1β基因前体肽的基因序列,通过T-A克隆构建了克隆载体pMD18T-IL1β。以克隆载体pMD18T-IL1β为模板,以设计合成的带酶切位点的引物分别扩增黄鳍鲷IL-1β的前体肽和预测的成熟肽基因序列,经BamHI和SalI双酶切后将其插入表达载体pQE30中,构建了原核表达质粒pQE30-pIL1β和pQE30-mIL1β。经酶切、PCR鉴定并最终通过序列测定表明,基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框都正确无误,为黄鳍鲷IL-1β基因的体外重组表达研究打下了基础。 相似文献
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《渔业科学进展》2015,(1)
以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了Activin两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了ActivinβA和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb和2.4 kb;在预测的ActivinβB转录起始位点(+1位)的上游31 bp处有1个典型的TATA box,而在ActivinβA中未发现TATA box的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF等结合位点,还发现了与内分泌相关的Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR等结合位点,但肌性转录因子Myo D、myogenin和雄性的性别决定基因SRY结合位点仅在ActivinβA启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆ActivinβA和βB表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。 相似文献