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非洲猪瘟血清学诊断靶点的研究进展 总被引：4，自引：4，他引：0
非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的猪高致死性传染病。ASFV编码蛋白p30、p54和p72等具有较高的免疫原性,且部分氨基酸序列较为保守,常被作为血清学诊断靶点,用于评价ASF不同阶段或发病程度的抗体水平变化,ASF血清学诊断靶点相关深入研究有助于其感染检测、致病机制和机体免疫系统反应等探究。本文系统阐述用于ASF血清学诊断的主要候选蛋白及其靶点的检测应用进展,并分析候选靶点的抗原表位（区域）及其抗体结合的特点,探讨其作为ASF血清学诊断新靶点的应用潜力。 相似文献
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为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2018,(12)
为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 相似文献
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。该病以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征,病程短,死亡率高达100%。世界动物卫生组织（OIE）和我国都将其列为一类动物疫病。ASFV可以在家猪、野猪和软蜱中循环传播,传播媒介为节肢动物。 相似文献
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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,病死率可达90%~100%。ASF不但对养猪业有严重的社会经济影响,而且严重影响和破坏了猪和猪产品的区域和国际贸易,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病之一,也是我国规定的一类动物疫病[1,2]。 相似文献
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《养猪》2021,(5)
为建立血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,研究真核表达ASFV CD2v重组蛋白,并以纯化的蛋白为包被抗原,通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原的最佳包被浓度为10μg/m L,待检血清的最佳稀释倍数为1∶25,最佳封闭液为1%BSA与明胶封闭缓冲液,酶标抗体最佳稀释度为1∶2 000,最优二抗稀释液为PBST,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.366。该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达1∶50,批内重复性和批间重复性变异系数分别为2.2%～9.4%和4.7%～8.1%。试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可初步应用于ASFV抗体检测。 相似文献
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1前言非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病,又称非洲猪瘟疫,或疣猪病。该病在非洲的 相似文献
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【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具... 相似文献
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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病,急性病例的发病率和死亡率几乎达100%。世界动物卫生组织将ASF列为法定报告动物疫病,中国将其列为一类动物疫病。当前中国ASF疫情防控形势十分严峻,且尚无有效的疫苗及其他防治制剂,因此执行严格的卫生措施及监测病原和抗体,进而排查和清除带毒动物是ASF防控的重要措施。笔者就ASFV诊断标识出发,总结了近年来ASF病原检测与血清学监测技术的最新研究进展。抗原检测方面,在PCR基础上发展的多种等温扩增技术如重组酶聚合酶扩增技术、交叉引物扩增技术、环介导等温扩增技术及微滴数字PCR从不同方面克服了常规PCR的缺陷,实时荧光定量PCR检测方法具有速度快、准确、结果客观和可定量基因组含量等优点,新型CRISPR/Cas12a技术无需昂贵的仪器,可为ASFV的检测提供一种更加便携、简单、灵敏和特异性强的新型替代方法;抗体检测方面,基于酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析技术和间接免疫荧光试验等的检测方法灵敏度和特异性也有不同程度的提高。 相似文献
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非洲猪瘟病毒强免疫原性重组CD2v抗原的制备与初步应用 总被引：2，自引：2，他引：0
旨在获得非洲猪瘟病毒（ASFV）强免疫原性重组CD2v抗原,利用生物信息学软件进行CD2v抗原指数分析,将其细胞质内免疫显性区与类弹性蛋白多肽（ELP）在重组大肠杆菌中进行融合表达,对ELP-CD2v融合蛋白的相变循环（ITC）条件进行优化,在优化条件下进行融合蛋白纯化,利用烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,通过免疫转印法对重组CD2v抗原进行鉴定,利用重组CD2v抗原建立ELISA抗体检测方法,与多抗原ELISA对ASFV抗体阳性和阴性血清进行平行检测。结果显示,ELP-CD2v融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC条件为28℃和1.5 mol·L-1 NaCl,在0.2% Triton X-100存在下进行ITC,纯化的融合蛋白纯度为76.3%;TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,再次ITC回收的重组CD2v抗原纯度为91.7%,能被ASFV抗体识别;根据多抗原ELISA检测结果选择血清样品,用重组CD2v抗原ELISA进行检测,结果显示,15份ASFV抗体阴性血清均为CD2v抗体检测阴性,15份ASFV抗体阳性血清均为CD2v抗体检测阳性。这些研究结果表明,ASFV的CD2v蛋白胞内区存在强免疫原性表位,其重组抗原有望用于CD2v的抗体检测。 相似文献
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ZHOU Xiaohui XIAO Jingjing ZHANG Xinyu ZHANG Quan XIA Xiaoli SUN Huaichang 《畜牧兽医学报》1956,51(10):2472-2480
To obtain the highly immunogenic recombinant CD2v antigen of African swine fever virus (ASFV), the amino acid sequence of CD2v was analyzed for antigenic index using bioinformatics software and the intracytoplasmic region with high antigenic index was expressed in E. coli as an elastin-like polypeptide (ELP) fusion protein. After optimization of the conditions for inverse transition cycling (ITC), ELP-CD2v fusion protein was purified by ITC in the presence of different concentrations of Triton X-100 and the ELP tag was cleaved with active inclusion bodies of tobacco etch virus (TEV) protease. The tag-free recombinant CD2v antigen was recovered by an additional round of ITC and identified by Western blotting. By using the recombinant CD2v antigen, an indirect ELISA was established and used to detect ASFV antibody-positive and antibody-negative sera in parallel with the multi-antigen ELISA. The results showed that ELP-CD2v fusion protein was expressed correctly in E. coli with an optimal transition temperature of 28 ℃ at 1.5 mol·L-1 NaCl. After one cycle of ITC in the presence of 0.2% Triton X-100, ELP-CD2v fusion protein was purified to 76.3% purity. The ELP tag was cleaved efficiently with the TEV protease and removed after an additional round of ITC. The recovered recombinant CD2v protein had a purity of 91.7%, which was recognized by pig anti-ASFV serum. For 30 serum samples detected by ASFV multi-antigen ELISA, recombinant CD2v ELISA showed that all of 15 antibody-negative sera were CD2v antibody negative and all of 15 antibody-positive sera were CD2v antibody positive. These data suggest that the presence of immune dominant epitopes in the intracytoplasmic region of CD2v protein and the potential application of the recombinant CD2v antigen for ASFV antibody detection. 相似文献
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为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。 相似文献
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旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明146PAEPYTT152为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2 μg·mL-1),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05% PBST溶液稀释5 000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1 600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。 相似文献
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非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。 相似文献
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为了获得无标签重组抗原用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测,本研究将B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)基因进行融合表达,利用简单、经济的相变循环(ITC)纯化ELP-B602L融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,再用ITC回收重组B602L蛋白;用抗体阳性猪血清对重组B602L进行鉴定;以重组B602L蛋白为包被抗原进行ELISA鉴定。结果显示重组大肠杆菌能正确表达ELP-B602L融合蛋白,纯化融合蛋白纯度大于85%;TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签的效率大于90%,回收的重组B602L蛋白纯度大于90%,能与抗体阳性猪血清反应;以重组B602L蛋白为包被抗原建立的ELISA与抗体阳性血清反应为阳性,与抗体阴性血清反应为阴性,OD450值与血清稀释倍数具有线性相关性。 相似文献
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Comparison of two antigens for use in an enzyme-linked immunosorbent assay to detect African swine fever antibody 总被引：3，自引：0，他引：3
Two African swine fever virus (ASFV) antigens were tested for use in an ELISA to detect antibody to ASFV. Antigens used were the cytoplasmic soluble fraction (CS-P) of infected cells grown in the presence of porcine serum and the semipurified viral structural protein VP73 (SVP73). Both antigens were tested by ELISA against 72 sera obtained during several ASF field episodes and from ASFV-inapparent carriers. Of the 72 sera, only 2.8% has positive results by ELISA against CS-P antigen; 60% of positive-reacting sera (to both antigens) had higher ELISA values when the CS-P antigen was used. Samples (with positive results) that reacted only to CS-P antigen had results confirmed by immunoblot analysis. Such sera reacted against ASFV-infection proteins IP25, IP25.5, and IP30, but not against IP73. In time-course experiments to detect appearance of ASFV-antibodies in infected miniature pigs, antibodies were detected by immunoblot analysis on postinoculation day (PID) 8. At that time, only the polypeptides IP25, IP25.5 IP30, and IP31 were recognized; IP73 and IP12 were first detected 3 and 4 days later, respectively. In the same experiments, ASFV antibodies were detected by ELISA, using CS-P or SVP73 antigens, on PID 7 and 9, respectively. These results could explain the percentage of sera not having positive results by ELISA using SVP73 antigen, if the sera were obtained from ASFV-infected pigs during the first days of infection before induction of antibody response against the IP73 protein. This feature makes the use of CS-P antigen advantageous in early serologic detection of ASFV-infected pigs. 相似文献
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为进一步深入研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列（登录号：NC_001659.2）设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1：128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。 相似文献