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1.
为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。 相似文献
2.
试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。 相似文献
3.
试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。 相似文献
4.
本试验用布鲁氏菌强、弱毒株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,旨在探讨NF-κB信号通路与布鲁氏菌强、弱毒株在胞内生存的关系。采用光滑型牛布鲁氏菌2308、粗糙型牛布鲁氏菌RB51在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,侵染0、4、8、24 h后,裂解细胞收集蛋白,Western blotting检测布鲁氏菌对激活NF-κB信号通路的影响。利用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,然后用布鲁氏菌在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量;同时对胞内菌CFU进行计数。结果显示粗糙型牛布鲁氏菌RB51可以强烈激活NF-κB信号通路,光滑型牛布鲁氏菌2308对其激活作用较弱;同时对NF-κB信号通路的激活具有浓度依赖性,在感染复数为80:1、侵染时间为8 h时光滑型牛布鲁氏菌2308和粗糙型牛布鲁氏菌RB51对NF-κB激活程度最强,且该通路参与产生TNF-α、IL-1β和IL-6;NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082影响布鲁氏菌在胞内的生存。因此,粗糙型牛布鲁氏菌RB51胞内存活与NF-κB信号通路密切相关,为进一步研究布鲁氏菌的胞内致病机制奠定基础,也为布鲁氏菌新型药物的研发、家畜布鲁氏菌病预防和治疗提供科学依据。 相似文献
5.
本研究旨在研究布鲁菌糖基转移酶(WboA)在诱发胚胎滋养层细胞(HTP-8)炎症反应中的作用。以羊种布鲁菌M5-90为模板,扩增WboA基因,构建pET28a(+)-WboA重组表达质粒,转化重组质粒在BL21(DE3)中表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,并对重组WboA蛋白进行纯化。构建自杀载体pGEM-7zf-ΔWboA-SacB,通过同源重组的方法,筛选布鲁菌WboA基因缺失株ΔWboA,并进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。然后将纯化的WboA蛋白与ΔWboA分别作用于胚胎滋养层细胞,ELISA检测IL-6、IL-10、TNF-α和乳酸脱氢酶(LDH)的相对变化量。结果成功纯化了WboA蛋白,构建了ΔWboA,ΔWboA侵染胚胎滋养层细胞诱导产生炎症细胞因子IL-6、IL-10和TNF-α均低于M5-90对照组,差异显著(P<0.05),WboA蛋白作用胚胎滋养层细胞时,炎症细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组,差异极显著(P<0.01)。本研究表明WboA蛋白具有细胞毒作用,布鲁菌的致炎作用与脂多糖O链相关,为进一步阐明布鲁菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。 相似文献
6.
旨在探讨STAT6介导的巨噬细胞极化对布鲁氏菌胞内生存的影响。本研究采用布鲁氏菌光滑株S2308（S2308）和粗糙型疫苗株RB51（RB51）侵染巨噬细胞。利用qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标志因子p65、NOS2和IL-1β,M2型巨噬细胞标志因子STAT6、ARG1、IL-10的mRNA表达水平;流式细胞术检测M1型标记分子CD86和M2型标记分子CD206的表达;Western blot检测p-STAT6蛋白及抑制剂AS对蛋白的抑制作用;ELISA检测M1型细胞因子TNF-α、IL-12和M2型细胞因子IL-4、IL-10的表达量;最后对胞内菌落进行CFU计数。qRT-PCR结果显示,在感染8、12 h时可显著诱导M1型因子mRNA转录表达,72 h时低表达,而M2型因子在72 h时高表达;流式细胞术结果显示,S2308感染12 h可显著诱导CD86的表达,感染72 h可显著诱导CD206的表达,但RB51对二者无影响;Western blot结果显示,S2308菌株在感染72 h时激活STAT6信号通路,而RB51几乎不激活该通路,抑制剂AS在2 μmol·L-1浓度时抑制效果最佳;ELISA结果显示,AS抑制剂可显著抑制IL-4、IL-10的释放,并促进TNF-α、IL-12的释放;CFU计数结果显示,S2308组的胞内菌呈先降低后显著上升趋势,加入AS抑制剂后可显著抑制布鲁氏菌胞内复制。布鲁氏菌S2308在感染后期能够通过STAT6诱导M1型巨噬细胞向M2型转化,并促进Th2型细胞因子的释放,从而有利于布鲁氏菌的胞内生存。而RB51几乎不激活该通路,不影响胞内生存。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(6)
旨在研究山羊β防御素124(goat beta-defensin 124,gBD124)沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFPPuro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2μg·mL~(-1)嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达(P0.05),显著增加了RASA1基因表达(P0.05);gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达(P0.05);gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达(P0.05),下调了CCL5和IL-1α基因表达(P0.05);gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度(P0.05)。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度(P0.05)。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。 相似文献
8.
9.
【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同... 相似文献
10.
采取质粒shuffling方法,将含GFPmut1的pPS858和能在布鲁菌中复制的质粒pBBR1MCS-2经KpnⅠ酶切后连接,转化DH5α,利用双抗性筛选重组质粒pBBR1-GFP。将荧光质粒转入布鲁菌,获得荧光标记布鲁菌,并用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞J774A.1,探讨其用于细胞侵袭试验的可行性。结果显示,成功构建布鲁菌荧光报告质粒pBBR1-GFP,用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞后,在细胞内观察到带荧光的布鲁菌,且荧光强度与胞内细菌数成正比。细胞侵袭动态试验结果表明,细菌与细胞共孵育45min后,胞内细菌达到饱和。结果表明,成功构建了布鲁菌的荧光质粒报告系统,可用于布鲁菌细胞侵袭试验。 相似文献
11.
针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。 相似文献
12.
旨在研究山羊β防御素124（goat beta-defensin 124,gBD124）沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2 μg·mL-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达（P<0.05）,显著增加了RASA1基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达（P<0.05）;gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达（P<0.05）,下调了CCL5和IL-1α基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度（P<0.05）。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度（P<0.05）。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。 相似文献
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本研究试图寻找参与布鲁菌胞内感染相关的宿主相关基因,为从感染宿主角度阐述布鲁菌的致病机制奠定基础.布鲁菌感染小鼠巨噬细胞后,利用数字基因表达谱技术筛选小鼠巨噬细胞感染布鲁菌16M株的差异表达基因,并利用荧光定量PCR对差异表达基因进行验证.差异表达基因经GO Term、KEGG分析,识别感染后显著富集的信号通路.在感染后4h,筛选出差异表达基因3 576个,其中58％的基因表现上调.并且NOD凋亡信号通路、溶酶体信号通路、NOD受体信号通路、FcγR-介导的吞噬通路、p53信号通路、内质网蛋白处理相关通路被显著富集.利用数字基因表达谱技术成功分析巨噬细胞感染布鲁菌后转录组学变化,为布鲁菌致病机制的逐步阐述奠定基础. 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(12):2339-2343
为探讨成纤维细胞生长因子21(FGF21)对布鲁菌感染的抗炎作用,本试验检测患布鲁菌病羊外周血中FGF21的含量;体外试验使用FGF21与布鲁菌共培养后检测细菌存活率;分析FGF21对Raw264.7细胞毒性,并以FGF21预处理Raw264.7细胞后,使用布鲁菌侵染细胞,观察细胞因子的释放以及TLR/MyD88信号通路的变化。结果显示,患布鲁菌病羊外周血中FGF21的含量显著升高,FGF21并不影响布鲁菌的存活率且对Raw264.7细胞没有毒性;FGF21预处理后可以抑制布鲁菌侵染诱导的IL-6、TNF-α、MCP1和LDH的释放,并且FGF21可提高IL-10的含量;同时FGF21可降低布鲁菌侵染引起的TLR/MyD88表达的升高。结果表明,患布鲁菌病羊外周血中FGF21的含量显著升高,FGF21通过TLR/MyD88通路缓解布鲁菌侵染诱导的炎性细胞因子的释放。 相似文献
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为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63-887基因缺失株(16MΔDK63-887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63-887基因,获得突变株16MΔDK63-887。将亲本株16M、疫苗株M5-90、突变株16MΔDK63-887在相同条件下振荡培养,观察其生长趋势变化;将各菌株置于不同外界环境中,观察其生存率;将各菌株侵染小鼠巨噬细胞,比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT-qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63-887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16MΔDK63-887在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株;侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降;RT-qPCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P0.01),结果表明,布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。 相似文献
17.
采取质粒shuffling方法,将含GFPmut1的pPS858和能在布鲁菌中复制的质粒pBBRlMCS-2经KpnI酶切后连接,转化DH5a,利用双抗性筛选重组质粒pBBR1-GFP。将荧光质粒转入布鲁菌,获得荧光标记布鲁菌,并用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞J774A．1,探讨其用于细胞侵袭试验的可行性。结果显示,成功构建布鲁菌荧光报告质粒pBBR1-GFP,用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞后,在细胞内观察到带荧光的布鲁菌,且荧光强度与胞内细菌数成正比。细胞侵袭动态试验结果表明,细菌与细胞共孵育45min后,胞内细菌达到饱和。结果表明,成功构建了布鲁菌的荧光质粒报告系统,可用于布鲁菌细胞侵袭试验。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(8)
为了明确腐蹄病奶牛核因子κB(NF-κB)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的表达及变化情况,探讨奶牛腐蹄病炎性信号通路的作用,试验采用酶联免疫吸附试验检测腐蹄病奶牛(试验组)和健康奶牛(对照组)血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素4(IL-4)、p38MAPK和NF-κB的表达情况。结果表明:与对照组比,试验组奶牛血清中NF-κB和IL-1β含量显著升高(P0.05); IL-4含量极显著升高(P0.01);TNF-α含量显著降低(P0.05);p38MAPK含量升高,但差异不显著(P0.05)。说明NF-κB信号通路在奶牛腐蹄病促炎因子表达调控中可能起着重要作用, p38MAPK信号通路并不是腐蹄病发生期间诱导炎症反应的主要信号通路。 相似文献
19.
试验旨在探究黄芪多糖（Astragalus polysaccharide,APS）对LPS诱导的鸡巨噬细胞（HD11）炎症模型的抗炎效果和作用机制。用不同浓度的LPS刺激鸡巨噬细胞（HD11）,通过CCK8法检测细胞活力,实时荧光定量PCR检测白细胞介素-1β（IL-1β） mRNA表达的变化,以确定构建细胞炎症模型的LPS最适添加浓度。将HD11分为对照组（C）、脂多糖（LPS）组（L）、黄芪多糖（APS）组（A）和黄芪多糖抑制脂多糖组（A+L）,在LPS刺激后的2、6、12、24、48 h用实时荧光定量PCR法检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、核转录因子（NF-κBp65）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3） mRNA表达的变化,Western blotting法检测NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3蛋白含量变化,ELISA检测IL-1β和TNF-α蛋白含量变化。细胞活力和IL-1β检测结果表明,构建细胞炎症模型的LPS最适添加浓度为0.5 μg/mL。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,L和A组IL-1β、TNF-α、NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3 mRNA表达均显著升高（P<0.05）;与L组相比,A+L组在LPS刺激后的IL-1β、TNF-α、NF-κBp65和p38MAPK mRNA表达含量均显著降低（P<0.05）,SOCS3 mRNA表达显著增加（P<0.05）。Western blotting结果表明,与对照组相比,A组P-NF-κBp65/NF-κBp65、P-p38MAPK/p38MAPK和SOCS3/α-tubulin比值均显著增加（P<0.05）;与L组相比,A+L组P-NF-κBp65/NF-κBp65和P-p38MAPK/p38MAPK比值均显著降低（P<0.05）;A+L组SOCS3/α-tubulin比值显著升高（P<0.05）。ELISA结果表明,与对照组相比,L组IL-1β和TNF-α蛋白含量在2~48 h均显著增加（P<0.05）;与L组相比,A+L组IL-1β和TNF-α的蛋白含量在LPS刺激后12~48 h均显著降低（P<0.05）。以上结果表明,在LPS诱导的HD11细胞炎症模型中,APS通过促进SOCS3的表达抑制NF-κBp65和p38MAPK信号通路的过度活化,从而发挥抗炎作用。 相似文献
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《动物营养学报》2021,33(7)
本试验旨在研究植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制。试验利用植物乳杆菌预处理猪肠上皮细胞IPEC-J2 3 h,ETEC刺激细胞1、3、6、12和24 h,收集细胞及其培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,采用实时荧光定量PCR检测细胞中Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)以及NOD样受体3(NLRP3)和NOD样受体6(NLRP6)的表达,采用Western blot检测细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[p38和细胞外信号调节激酶(ERK)]和核转录因子-κB(NF-κB)p65的磷酸化水平以及紧密连接蛋白——闭合小环蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)和闭锁蛋白(occludin)的表达。分别采用p38 MAPK抑制剂、ERK-MAPK抑制剂和NF-κB p65抑制剂处理IPEC-J2细胞1 h,再用植物乳杆菌预处理细胞3 h,最后用ETEC处理细胞24 h,收集细胞和培养上清,采用ELISA法检测IL-1β、IL-8和TNF-α含量以及乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果表明:1)与ETEC处理相比,植物乳杆菌预处理能够极显著降低ETEC感染12～24 h细胞产生IL-1β、IL-8和TNF-α的含量(P0.01),显著或极显著提高ETEC感染3～12 h细胞中TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6的mRNA相对表达量(P0.05或P0.01),极显著降低ETEC感染24 h细胞中TLR2和NLRP3的mRNA相对表达量(P0.01),极显著降低ETEC感染3～6 h细胞中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平(P0.01),显著或极显著提高ETEC感染6～24 h细胞中ZO-1和occludin的表达量(P0.05或P0.01)。2)与ETEC处理相比,抑制剂和植物乳杆菌共同作用能够极显著降低ETEC感染细胞产生IL-1β、IL-8、TNF-α的含量和LDH的活性(P0.01),植物乳杆菌单独作用也可以极显著降低ETEC感染细胞产生LDH的活性(P0.01),并且信号通路抑制剂对植物乳杆菌调控部分促炎性细胞因子的产生有协同作用。综上所述,植物乳杆菌可以通过致弱p38 MAPK磷酸化和阻断NF-κB信号通路的活化而降低炎症相关因子的产生,从而表现出提高猪肠上皮细胞完整性的潜力。 相似文献