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1.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(10)
为了实现H9N2亚型禽流感病毒的HA基因在原核系统中高效表达,试验参考GenBank发布的禽流感病毒A/chicken/Gansu/2/99(H9N2) HA基因序列(登录号为EF070733.1),优化该密码子,化学合成HA基因,并将该基因连接至pET-28a(+)质粒载体中,构建pET-28a(+)-HA重组质粒,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后诱导表达,并优化诱导温度(16,25,30,37℃)、IPTG诱导浓度(0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)及诱导时间(2,4,6,8,10 h),用His-tag镍柱亲和层析纯化HA蛋白,并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果表明:成功构建重组基因工程菌pET-28a(+)-HA/BL21(DE3),其在30℃条件下,添加IPTG终浓度为0.8 mmol/L,诱导6 h时,HA重组蛋白表达量最佳。经His-tag镍柱纯化后在预期的63 ku处出现蛋白印迹条带。说明HA蛋白在大肠杆菌中成功表达。 相似文献
2.
构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
3.
为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。 相似文献
4.
《动物医学进展》2015,(7)
为了表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行研究,采用RT-PCR方法扩增猪戊型肝炎病毒(SHEV)ORF3完整基因,将扩增产物插入pMD19-T载体,再亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了pET-32a(+)-ORF3表达载体,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时对诱导表达条件进行筛选,并用SDS-PAGE和免疫印迹等方法分析鉴定表达产物。结果表明,成功扩增到345bp的目的基因片段,表达载体pET-32a(+)-ORF3转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,成功表达了ORF3基因编码的蛋白,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为6h时,该基因在E.coli BL21(DE3)中表达量最高。表达产物的分子质量约为29.6ku,与预期目的蛋白分子质量相符。表达的蛋白既有包涵体形式,也有可溶性形式。经Western blot检测,表达的目的蛋白能与SHEV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
5.
《中国兽医杂志》2014,(7)
从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因组中PCR扩增usp 45基因,与pMD-18T载体连接获pT-usp 45质粒;酶切鉴定并测序正确后,将usp 45基因克隆入原核表达载体pET-28a,获重组质粒pET-28a-usp 45,转入E.coli BL21(DE3);经IPTG诱导表达及镍亲和层析纯化,由SDS-PAGE和Westren blot进行鉴定。结果表明,本试验获得1 371 bp长度的usp 45基因,构建pET-28a-usp 45质粒,诱导表达并纯化分子量约50 kDa的目的蛋白,为进一步研究usp 45蛋白奠定基础。 相似文献
6.
为了制备大量廉价的可溶性犬细小病毒(CPV)VP2蛋白抗原,试验截选了VP2抗原表位集中的基因片段VP2-70进行密码子优化及合成,将合成基因克隆到pET-32a(+)载体中,构建原核表达载体pET-32-VP2-70,转化BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达后进行Ni-NTA亲和层析纯化,Western-blot检测验证其生物学活性。结果表明:试验构建的VP2-70表达载体能够介导VP2-70融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达量高出野生型VP2-70融合蛋白16 mg/L;Western-blot检测显示,该蛋白具有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。 相似文献
7.
《中国兽医学报》2017,(7):1261-1267
原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。 相似文献
8.
《中国兽医学报》2019,(8):1506-1512
通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrap~(TM)FF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。 相似文献
9.
为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni2+离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2017,(11):2114-2120
原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
11.
为了给表达高活性的抗菌肽Hadrurin提供开发应用的依据,进一步为用基因工程方法生产具有多种生物活性的抗菌肽Hadrurin蛋白提供研究基础,本研究表达获得重组抗菌肽Hadrurin(rHadrurin)蛋白的基础上,将纯化的rHadrurin蛋白进行肠激酶酶切,恢复其天然活性结构。用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)方法检测抗菌肽Hadrurin在不同剂量、不同pH值、不同保存温度下对鸡致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性及杀菌活性。并以小鼠为动物模型,进行抗菌肽rHadrurind对小鼠的体内保护实验。结果表明抗菌肽rHadrurin对上述细菌的最小抑菌范围为1.32μg/mL～4.32μg/mL,最小杀菌范围为1.77μg/mL～8.54μg/mL,而且-70℃～100℃及在pH3～pH10条件下仍具有高效抗菌活性。240μg/只剂量的抗菌肽蛋白可有效预防保护小鼠免受致死剂量鸡致病性大肠杆菌攻击,320μg/只剂量可达到保护率85%以上。 相似文献
12.
试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。 相似文献
13.
昆明抗真菌肽Thanatin基因的合成及原核表达 总被引：5，自引：3，他引：2
斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）抗真菌肽Thanatin是目前发现的6种昆虫抗真菌肽之一，对真菌具有广谱的免疫诱导杀菌活性，由21个氨基酸残基组成，对革兰氏阳性和阴性细菌也有一定的杀菌作用。根据已报道的抗真菌肽Thanatin基因的氨基酸序列，推导出cDNA序列，采用基因片段合成结合PCR扩增的策略，获得大量完整的Thanatin基因片段，通过T－A克隆法克隆至pGEM-T Easy载体，进行测序，结果证实合成的Thanatin基因与预期设计的完全一致。然后将其亚克隆至表达载体pET-21d中。经IPTG诱导表达后，采用RNA－DNA点杂交和RT－PCR检测具Thanatin基因插段的RNA转录表达活性，初步结果显示该融合表达产物对烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）和绿色木霉菌（Trichoderma riricle）2种病原真菌均有一定的抑菌效果。 相似文献
14.
斑腹刺益蝽 (Podisusmaculiventris)抗真菌肽Thanatin是目前发现的 6种昆虫抗真菌肽之一 ,对真菌具有广谱的免疫诱导杀菌活性 ,由 2 1个氨基酸残基组成 ,对革兰氏阳性和阴性细菌也有一定的杀菌作用。根据已报道的抗真菌肽Thanatin基因的氨基酸序列 ,推导出cDNA序列 ,采用基因片段合成结合PCR扩增的策略 ,获得大量完整的Thanatin基因片段 ,通过T A克隆法克隆至pGEM TEasy载体 ,进行测序 ,结果证实合成的Thanatin基因与预期设计的完全一致。然后将其亚克隆至表达载体pET 2 1d中。经IPTG诱导表达后 ,采用RNA DNA点杂交和RT PCR检测具Thanatin基因插段的RNA转录表达活性 ,初步结果显示该融合表达产物对烟曲霉菌 (Aspergillusfumigatus)和绿色木霉菌 (Trichodermariricle) 2种病原真菌均有一定的抑菌效果 相似文献
15.
对所分离鉴定的猪圆环病毒2型(PCV-2)ZZ株,参照GenBank中PCV-2全基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR扩增出PCV-2ORF2片段,原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET-ORF2,IPTG进行诱导表述,并进行Western blot分析。结果表明,PCR扩增产物长度为702bp,大小与预期的一致,成功构建重组质粒,经IPTG诱导成功获得分子质量约为30ku的表达蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性,为进一步研制PCV-2疫苗提供依据。 相似文献
16.
荚膜红细菌DSM1710中硫化物醌还原酶基因的克隆、表达及活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为获得有活性的硫化物醌还原酶(sulfide-quinone reductase,SQR)并研究其功能,试验利用常规PCR方法从荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)中克隆了SQR基因全长CDS区1284 bp;成功构建了SQR基因的原核表达载体pRSETA-SQR,并转入大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,SQR融合蛋白成功表达,在37 ℃条件下,0.4 mmoL/L IPTG诱导表达6 h,50 ku的SQR融合蛋白表达量最高。可溶性分析结果表明,SQR重组蛋白以包涵体形式存在,经过纯化、复性后得到较高纯度的SQR活性蛋白。蛋白活性分析结果表明,该酶具有明显的消化底物decyl-UQ的能力,测定其酶活Km值约为4。 相似文献
17.
通过RT-PCR技术从细胞毒液中扩增N蛋白cDNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,所获得的重组质粒pET-28a-N经酶切鉴定正确后,将其转化入表达菌E.coliBL21plysS诱导表达,用SDS-PAGE与Western blotting对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为372 bp的N蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h蛋白表达量最高,出现分子质量约为18 ku的目的蛋白带,与N蛋白的理论值相符。经Western blotting检测,该表达产物可与PRRSV阳性血清发生特异性反应。获得的PRRSV N蛋白为建立针对该病毒抗体的间接ELISA检测方法,以及为进一步研发PRRS抗体检测试剂盒奠定了基础。 相似文献
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为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
19.
根据GenBank(D12692.1)上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计、合成1对特异性的引物,采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫HSP70基因片段,将扩增产物与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;用pGEX-4T-1表达载体构建重组质粒pGEX-HSP70,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果表明:扩增的HSP70基因与D12692.1序列同源性为99.3%;表达的融合蛋白分子质量约为68ku,而且可与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生特异性反应。 相似文献