共查询到20条相似文献，搜索用时 390 毫秒
1.
人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)具有刺激细胞增殖的强大能力,是伤口愈合的关键因子.利用转基因技术,在家蚕后部丝腺利用丝素轻链基因(fibroin light chain,FibL)启动子驱动FibL-hEGF融合蛋白的表达.借助piggyBac转座子将FibL-hEGF融合基因导入到家蚕基因组,利用荧光检测总共获得8个转基因阳性卵圈,转基因阳性率为36.36％.PCR和反向PCR检测证明外源融合基因FibL-hEGF已被成功整合到家蚕基因组中,且随机插入到家蚕染色体的5个位点.Western blotting检测表明FibL-hEGF融合蛋白在家蚕后部丝腺中表达且成功分泌到蚕茧中,进一步证实了转基因家蚕的产生.本研究中利用piggyBac转座子介导的转基因技术成功获得了转基因家蚕并得到重组hEGF蚕丝,该蚕丝可用于制造伤口敷料. 相似文献
2.
家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径。将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP 4Hα)通过piggyB ac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达。利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源piggyB ac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上。实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在极显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP 4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍。利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5 d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP 4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达。 相似文献
3.
剪接因子Prp5是一种三磷酸腺苷(ATP)水解酶/RNA解旋酶,在内含子的识别和预剪接体的组装过程中具有重要的调控作用。分别克隆了酵母(Saccharomyces cerevisiae)与人(Homo sapiens)Prp5蛋白的核心编码序列Sc Prp5-M和h Prp5-M,然后在序列上游分别添加8×His标签序列,再与转基因质粒p Bac-Seri1-IE1ds Red(含seri1基因启动子和信号肽序列)进行重组,得到p Bac-Sc Prp5-M和p Bac-h Prp5-M转基因质粒。利用家蚕转基因技术将转基因质粒分别注射到蚕卵中,通过串联红色荧光标记筛选阳性转基因家蚕,在基因组水平检测到有Sc Prp5-M和h Prp5-M插入的家蚕个体,进一步的RNA和蛋白质检测也证明2种外源蛋白在家蚕中部丝腺中特异性表达,并且在5龄第4天和第5天的表达量较高。此外,在家蚕中部丝腺表达的2种重组蛋白均能随丝蛋白分泌到体外存在于茧层中,经裂解和纯化后,每1 g鲜茧茧层可分别获得6.25μg重组Sc Prp5-M蛋白和12.5μg重组h Prp5-M蛋白。利用家蚕丝腺生物反应器表达外源Prp5蛋白,为进一步研究Prp5蛋白的功能奠定了一定的实验基础。 相似文献
4.
家蚕丝腺拥有较强合成丝蛋白的能力,通过利用这一能力,使其能够大量生产有价值的蛋白,人们开始引入转基因家蚕,使它能够在丝腺中合成重组蛋白并分泌到蚕茧中。获得的重组蛋白可在生物学、生物技术,和药学领域中得到广泛应用。我们通过控制合成蛋白在丝腺中的定位,在后部丝腺(PSG)中表达重组蛋白使其定位在不能溶解的丝素中,在中部丝腺(MSG)中表达则定位于亲水外层的丝胶层中。本文主要讨论将转基因家蚕丝腺生物反应器作为优良工具,应用于大量生产药用蛋白和在工业化水平生产相关重组蛋白的可能性,以及生产重组蛋白过程中所面临的挑战和未来的应用前景。 相似文献
5.
采用基因打靶技术对家蚕丝素蛋白基因(fib)进行分子设计与遗传改造,探讨从基因水平改良蚕丝性能的可行性。以家蚕丝素轻链基因(fib-L)终止密码子TAA上游1.2 kb(fib-LL)和下游0.5 kb(fib-LR)片段作为基因打靶载体的左右同源臂,将绿色荧光蛋白基因(gfp)插入到两同源臂的中间,并使其与fib-L基因处于同一读码框,构建基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。将该载体质粒转染BmN细胞后,荧光显微镜下观察细胞呈现绿色荧光,表明载体构建成功。将该载体质粒通过精子介导法导入家蚕品种高白的卵,在G0代筛选出茧呈绿色荧光的家蚕,并通过PCR检测证实其为转基因家蚕;用GFP抗体对G3代转基因家蚕幼虫后部丝腺组织进行Western blotting检测,有分子质量为65 kD的Fib-L-GFP融合蛋白特异性条带呈现。转基因家蚕所产蚕丝在蓝光的激发下发出绿色荧光,表明通过基因打靶将gfp导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。 相似文献
6.
7.
P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。 相似文献
8.
为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部;克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光;克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。 相似文献
9.
人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)在转基因家蚕丝腺中的特异表达 总被引：3，自引：1，他引：2
家蚕丝腺具有强大合成与分泌蛋白质的能力,利用其作为生物反应器生产高附加值外源蛋白有着广阔的市场前景。以人血白细胞基因组DNA为模板,扩增并克隆了人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)核苷酸序列。序列分析表明,克隆的hBDNF核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号:NM_170735)的同源性为100%。随后采用家蚕丝胶基因(Ser1)启动子,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,将hBDNF构建到piggyBac转座表达载体并注射入家蚕早期胚胎,在G1代筛选获得了54头转基因阳性个体。经分子检测证实,hBDNF已整合到家蚕基因组并在丝腺有较高水平的特异表达。 相似文献
10.
《蚕业科学》2017,(5)
正1 MA S Y,XIA X J,LI Y F,SUN L,LIU Y,LIU Y Y,WANG X G,SHI R,CHANG J S,ZHAO P,XIA Q Y.Increasing the yield of middle silk gland expression system through transgenic knock-down of endogenous sericin-1.Mol Genet Genomics,2017,292(4):823-831题目利用转基因技术下调丝胶蛋白sericin-1的表达提高家蚕丝腺表达系统中外源蛋白质的产量摘要迄今为止已建立了多种转基因生物反应器来满足日益增长的外源重组蛋白表达需求。家蚕丝腺是一种潜在的可商业化应用,大规模、低成本生产重组蛋白的高效生物反应器。但是,由于用现有家蚕丝腺表 相似文献
11.
本试验旨在从山羊瘤胃中分离、筛选和鉴定单宁降解菌。从隆林山羊瘤胃采集内容物,采用单宁浓度耐受培养基进行初筛,再采用单宁酶活力鉴定培养基分离、筛选单宁降解菌,筛选出的细菌通过16S r DNA基因序列测定初步鉴定,将菌株在单宁浓度为0.5%、1%、1.5%的单宁酶诱导培养基中培养,测定酶活力。结果表明:共分离、筛选到4株降解单宁的细菌,根据16S r DNA基因序列分析结果,分别为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、克斯特菌(Kerstersia)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。经单宁酶诱导培养基培养后,Kerstersia的胞内单宁酶活力高于其他3株菌,而其他3株菌的酶活力较为接近;Kerstersia、Providencia vermicola和Pseudomonas aeruginosa经1%单宁浓度诱导的单宁酶活力均高于经0.5%和1.5%单宁浓度诱导(P0.05)。本试验成功从山羊瘤胃中筛选、分离、鉴定出4株单宁降解菌,且它们均表现出较高的单宁酶活力。 相似文献
12.
为制备抗流感病毒(AIV)聚合酶PB1-1蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用RT-PCR技术扩增H5N1亚型AIV聚合酶PB1部分基因片段,并将其克隆至载体pET-32a,转化至BL21细菌进行重组蛋白表达.靶蛋白经Ni+柱纯化后,western blot分析证实该重组蛋白与AIV阳性血清具有良好的免疫反应性.用纯化的PB1-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆纯化后获得2株能稳定分泌抗H5亚型PB1 MAb的细胞株CGFF10和FGFCE5,2株杂交瘤细胞的细胞培养上清及腹水效价分别为103、103和106、107.2株MAb的亚类均为IgG1.实验证明:所制备的MAb能与H5N1亚型PB1-1抗原发生特异反应,具有免疫活性,从而为PB1结构及功能的深入研究奠定了基础. 相似文献
13.
本研究分离得到两株猪源H1N1流感病毒,通过进化树分析发现分别是欧亚类禽H1N1猪流感病毒和类鸭源H1N1猪流感病毒,为了研究两株毒株的NS1蛋白对Ⅰ型IFN产生的抑制能力,分别构建了2个毒株的NS1基因的真核表达载体,将NS1真核表达质粒、Ⅰ型IFN报告质粒与干扰素刺激质粒RIG-I共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测Ⅰ型IFN激活水平。结果显示:欧亚类禽H1N1猪流感病毒NS1蛋白对人源细胞干扰素的拮抗作用明显强于类鸭源H1N1猪流感病毒;2种NS1蛋白对RIG-I与TBK-1激活的IFN-I抑制能力存在显著的差别,但是对IRF-3激活的IFN-I抑制能力没有显著差别。本研究结果初步揭示了欧亚类禽与类鸭源H1N1猪流感病毒抑制IFN-I能力的差异,及H1N1禽流感适应猪群的潜在分子机制。 相似文献
14.
《畜牧与兽医》2017,(2):51-56
为分析T1R1(味觉受体1家族Ⅰ型)、T1R3(味觉受体1家族Ⅲ型)及PepT1(Ⅰ型寡肽转运载体)基因对湖羊氨基酸吸收的影响,以6月龄的湖羊为试验材料,采用荧光定量PCR技术对湖羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的T1R1、T1R3和PepT1基因的表达量进行相对定量分析。结果表明:T1R1和T1R3基因在检测的各段组织中均有表达,而PepT1基因在结肠中不表达;其中T1R1和T1R3基因在十二指肠中表达量最高,其次是空肠,并且两者差异显著极显著(P0.01);T1R1和T1R3基因在十二指肠(P0.01)和空肠(P0.05)中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著或显著;Pep T1基因在空肠中表达量最高,其次是回肠,并且两者差异极显著(P0.01);Pep T1基因在空肠和回肠中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著(P0.01)。该结果为进一步研究T1R1、T1R3和Pep T1基因对湖羊氨基酸吸收相关功能影响奠定基础。 相似文献
15.
16.
17.
Sugi T Kato K Kobayashi K Kurokawa H Takemae H Gong H Recuenco FC Iwanaga T Horimoto T Akashi H 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2011,73(10):1377-1379
Bumped kinase inhibitors (BKIs) target analog-sensitive kinases, which the genomes of mammals rarely encode. Previously, we demonstrated that a BKI effectively suppressed the in vitro replication of Toxoplasma gondii, the causative pathogen of toxoplasmosis, by targeting T. gondii calcium-dependent protein kinase 1 (TgCDPK1) (Eukaryotic Cell, 9: 667-670). Here, we examined whether the BKI 1NM-PP1 reduced parasite replication in vivo. A high dose of 1NM-PP1, by intraperitoneal injection, just before the parasite inoculation effectively reduced the parasite load in the brains, livers, and lungs of T. gondii-infected mice, however, a low dose of 1NM-PP1 with oral administration didn't change the survival rates of infected mice. 相似文献
18.
19.