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1.
【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失... 相似文献
2.
【目的】通过构建鸭疫里默氏杆菌RIA_0940基因缺失株并测定其生物学特性,探讨RIA_0940基因的潜在功能。【方法】以鸭疫里默氏杆菌RA-GD株为亲本株,扩增其左右同源臂及红霉素抗性基因（ermR）盒片段,构建左同源臂-ermR抗性基因盒-右同源臂融合片段,通过自然转化的方法缺失RA-GD株RIA_0940基因,并利用PCR筛选、鉴定RA-GDΔRIA_0940基因缺失株。分别对亲本株RA-GD和缺失株RA-GDΔRIA_0940的生长特性、对雏鸭的半数致死量、感染鸭血液和组织载菌量及对Vero细胞的黏附和入侵性能进行比较分析。【结果】试验成功构建了RA-GD株的RIA_0940基因缺失株（RA-GDΔRIA_0940）;生物学特性检测结果显示,RA-GDΔRIA_0940株体外生长能力较亲本株低,基因缺失株在生长后期生长受到显著或极显著抑制（P<0.05;P<0.01）;RA-GDΔRIA_0940株对雏鸭的半数致死量是亲本株的114倍;与亲本株相比,缺失株感染鸭血液和组织的载菌量显著或极显著下降（P<0.05;P<0.01）;缺失株对Vero细胞的黏附和入侵性能均极显著低于亲本株（P<0.01）。【结论】本试验成功构建RA-GD株RIA_0940基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下生长能力较亲本株低,对雏鸭的致病力、感染鸭血液和组织载菌量及对Vero细胞的黏附和入侵性能均显著或极显著低于亲本株。本试验结果为深入研究鸭疫里默氏杆菌的分子致病机理和研制基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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【目的】 研究inlK基因对Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影响及其生物被膜与消毒剂抗力的关系,以期为有效防控单增李斯特菌污染提供参考。【方法】 以单增李斯特菌Lm90SB2为试验菌,根据GenBank中公布的单增李斯特菌F2365 inlK基因序列(登录号:AE017262),应用Primer Premier 5.0软件设计用于扩增inlK基因上、下游同源臂片段及验证缺失株的特异性引物,以同源重组技术构建inlK基因缺失株,并通过旁外侧引物运用PCR方法进行缺失株检测。将标准菌株Lm90SB2和构建的缺失株分别培养8、12、24、48 h后进行结晶紫染色,在倒置显微镜下观察形态变化,并用酶标仪测定生物被膜形成能力;用含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液作为新洁尔灭消毒剂的中和剂,含5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L硫代硫酸钠+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液84消毒剂的中和剂,设消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液+中和剂、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌悬液、稀释液+菌悬液(阳性对照)、稀释液+中和剂+培养基(阴性对照)6个试验组,进行中和剂的筛选,并检测不同浓度新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)分别作用1、5、10、20 min时对2株菌的灭菌率。【结果】 PCR结果表明,成功构建了缺失株Lm90SB2ΔinlK,且inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01);含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液构成的中和剂可有效中和新洁尔灭消毒剂,5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液可有效中和84消毒剂。不同比例的新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)消毒剂在1、5、10 min对Lm90SB2ΔinlK株的灭菌率均显著或极显著高于Lm90SB2株(P<0.05;P<0.01),且在20 min时灭菌率均为100%。【结论】 inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力下降,且对消毒剂抗力减弱。 相似文献
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【目的】 试验旨在阐明双元调控系统LisRK在单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)抵抗不利环境应激以及感染过程中的作用。【方法】 以参考菌株10403S为亲本株，利用穿梭质粒pKSV7通过同源重组方法构建lisRK基因缺失株，并基于表达质粒pIMK2构建了lisRK回补株；比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK在酸(pH 4.5)、渗透压(5% NaCl)和氧化(10 mmol/L H2O2)应激条件下的生长与存活能力及其对胃腺癌细胞MGC803和肠上皮细胞Caco-2的侵袭率，进一步比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK经腹腔注射感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量。【结果】 应激试验结果显示，lisRK基因缺失显著降低单增李斯特菌在酸应激(pH 4.5)条件下的生长能力，但不影响该菌在5% NaCl和10 mmol/L H2O2中的生长能力；缺失株ΔlisRK在强酸应激条件下(pH 2.5)的存活率(0.57%)极显著低于亲本株(2.07%)与回补株(1.97%)(P < 0.01)。细胞侵袭试验显示，缺失株ΔlisRK对肠上皮细胞Caco-2和胃腺癌细胞MGC803的侵袭率分别为2.04%和0.13%，极显著或显著低于亲本株与回补株(P < 0.01；P < 0.05)。小鼠感染试验显示，在感染后48 h，缺失株ΔlisRK在小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为7.42×107和1.87×107 CFU，均低于亲本株和回补株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量，但并无显著性差异(P > 0.05)。【结论】 双元调控系统LisRK缺失减弱单增李斯特菌的抗酸应激能力和对宿主细胞的侵袭能力。 相似文献
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【目的】 克隆鸡Msh同源框2(Msh-homeobox 2，MSX2)基因，并对其进行生物信息学和胚胎期表达模式分析，为进一步研究MSX2基因的结构和功能提供支持。【方法】 对80枚琅琊鸡种蛋进行孵化，分别于孵化期第1、2、3、4、5、6、9、12、15、18天采集样品(1~6胚龄采集整胚，9、12、15、18胚龄分别采集心脏和肝脏)，提取总RNA，利用RT-PCR方法扩增并克隆MSX2基因，对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术分析MSX2基因在琅琊鸡鸡胚和组织中的表达水平。【结果】 成功克隆了琅琊鸡胚MSX2基因，序列长度为818 bp，开放阅读框为780 bp，编码259个氨基酸。琅琊鸡MSX2氨基酸序列与日本鹌鹑、秃鹰和仓鸮的相似性最高，均为99.23%，与山羊的相似性最低，为74.54%;系统进化树分析结果显示，琅琊鸡与日本鹌鹑聚为一类。生物信息学分析表明，MSX2蛋白分子质量为28 235.18 u，等电点(pI)为9.71，没有信号肽和跨膜域，为不稳定的亲水性蛋白，主要分布在细胞核(60.9%);存在37个磷酸化位点、8个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点;二级结构主要由无规则卷曲(63.32%)和α-螺旋(28.19%)组成。实时荧光定量PCR分析表明，MSX2基因在整胚(1~6胚龄)中的表达水平呈现先上升后下降趋势，且在4胚龄时表达水平最高，极显著高于1、2、3胚龄(P<0.01);MSX2基因在12胚龄鸡心脏中的表达水平极显著低于9胚龄(P<0.01);在9~18胚龄鸡肝脏中的表达量呈逐渐下降趋势，且在9胚龄鸡肝脏中表达水平最高(P<0.05)。【结论】 试验成功克隆了琅琊鸡MSX2基因序列，其表达模式在不同胚龄和同一胚龄不同组织间存在差异，为进一步探索琅琊鸡MSX2基因的结构和功能奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(6):950-956
为探究InlA、InlB和InlJ对单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力及在其侵袭MBMEC过程中对细胞骨架与细胞紧密连接的影响,本试验以致绵羊脑炎分离株LM90为亲本株,构建单基因缺失株LM90-△InlA、LM90-△InlB和LM90-△InlJ,通过LD50、溶血试验、MBMEC黏附侵袭、胞内增殖及细胞免疫荧光染色方法,研究LM缺失株和亲本株的差异。结果显示,InlA、InlB和InlJ基因缺失株的LD50分别比LM90高出101.5,101.3,101.33倍;对MBMEC的黏附率、侵袭率及胞内增殖都显著下降,且侵袭率差异显著(P0.05),溶血性无变化;免疫荧光染色结果表明,InlB缺失株不能使MBMEC细胞骨架发生重排,InlA缺失株细胞骨架重排不明显,InlJ缺失株与亲本株则使细胞骨架完全破坏;LM90与InlA、InlB和InlJ缺失株都使MBMEC细胞间紧密连接蛋白呈不连续分布,而阴性对照则呈连续分布。结果表明,InlA、InlB和InlJ与LM毒力密切相关,且在LM侵袭MBMEC过程中,InlB影响MBMEC细胞骨架重排,InlA对其影响弱于InlB,InlJ则影响微弱或者不影响。LM可引起细胞间紧密连接改变,但InlA、InlB和InlJ在该过程中几乎不发挥作用。 相似文献
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沙门菌血清D群3个血清型FliC蛋白氨基酸序列比对分析表明肠炎沙门菌与鸡伤寒沙门菌完全相同，二者与鸡白痢沙门菌存在第91位氨基酸位点差异。本研究旨在探究肠炎沙门菌FliC蛋白第91位精氨酸突变对鞭毛形态、细菌运动性和小鼠体内定植能力的影响。运用λ-Red同源重组技术删除肠炎沙门菌CICC10467 fliC基因，构建系列反式回补突变株，通过体外生长特性试验和Western blot试验分析各菌株生长和FliC蛋白表达情况，运动性试验分析各菌株在半固体琼脂中的泳动能力，电子显微镜观察各菌株鞭毛形态，细胞感染试验分析各菌株的细胞黏附和入侵能力，动物感染试验分析各菌株的组织侵染能力。结果表明，fliC基因缺失株及点突变回补株与野生株的体外生长能力无显著差异（P ≥ 0.05）。fliC基因缺失后肠炎沙门菌不表达鞭毛蛋白，各点突变回补株与野生株鞭毛蛋白表达量无明显差异。FliC蛋白R91S突变导致肠炎沙门菌鞭毛形态由超螺旋形态转变为钝直、柔韧度减弱，运动性显著降低（P<0.000 1），对RAW264.7和HCT116细胞的黏附入侵能力显著下降（P<0.001），对BALB/c小鼠的器官侵染能力显著减弱（P<0.001）。综上表明，FliC蛋白第91位精氨酸对维持细菌运动性至关重要，第91位精氨酸突变能够显著改变肠炎沙门菌鞭毛形态，减弱肠炎沙门菌在小鼠体内定植能力。 相似文献
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大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli type III secretion system 2，ETT2）参与禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用的影响，为进一步阐明ETT2的致病机制提供依据。基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建epaPQR基因缺失株和回复株，通过生长曲线测定、运动性和生物被膜形成能力等试验，分析epaPQR基因对APEC生物学特性的影响；通过血清杀菌与组织载菌量等试验分析epaPQR基因对APEC致病性的影响。结果表明，成功构建ETT2结构基因epaPQR基因缺失株和回复株，epaPQR基因缺失后，其生长能力和生物被膜形成能力并没有显著改变（P>0.05）；但epaPQR基因缺失后，其运动能力显著降低（P<0.05），在透射电镜下观察到缺失株鞭毛数量明显减少，通过荧光定量PCR发现，鞭毛T3SS结构基因及鞭毛输出蛋白基因的转录水平均显著下调（P<0.05）。epaPQR基因缺失后其抗血清杀菌能力显著增强（P<0.05），缺失株AE81ΔepaPQR在雏鸡体内不同器官的定殖能力显著降低。结果说明，ETT2结构基因epaPQR参与调控APEC的鞭毛形成，影响APEC抗血清杀菌能力以及在体内组织器官的定殖能力，表明epaPQR在APEC致病过程中发挥重要作用，本研究为深入探究ETT2功能和APEC致病机制提供参考。 相似文献
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本试验研究了植物乳杆菌发酵培养物对单增李斯特菌感染肉仔鸡的生产性能、氧化反应及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的影响,旨在探讨植物乳杆菌发酵培养物对单增李斯特菌感染肉鸡的治疗效果及机制。选择1日龄AA公雏480只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组和感染组饲喂基础日粮,抗生素组、乳杆菌培养物组在基础日粮中分别添加40 mg/kg盐酸恩诺沙星和1.6 g/kg灭活植物乳杆菌培养物。5日龄时,感染组、抗生素组和乳杆菌培养物组每只鸡灌服1 mL（105 CFU）单增李斯特菌感染液,对照组灌服无菌株培养液,全程试验期28 d。结果显示,与感染组相比,植物乳杆菌培养物可以显著提高7和28 d肉仔鸡平均日增重、平均日采食量和始末体重（P<0.05）,显著降低肉仔鸡料重比（P<0.05）;显著降低14和28 d肉仔鸡血清和十二指肠黏膜中的二胺氧化酶、丙二醛、蛋白羰基（除14 d十二指肠黏膜外）的含量（P<0.05）;显著降低7和28 d肉仔鸡MAPK3、MAPK10和DUSP6（7 d除外）基因mRNA表达水平（P<0.05）。综上,日粮中添加植物乳杆菌发酵培养物可以提高肉鸡抗氧化性,抑制单增李斯特菌的感染,提高抗菌能力,通过MAPK信号提高抗炎能力。植物乳杆菌发酵培养物对单增李斯特菌感染肉鸡有较好的治疗效果,可以作为替代抗生素的添加剂。 相似文献
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试验旨在分析糖基转移酶编码基因WadC影响布鲁氏菌胞内存活的作用。以羊种布鲁氏菌Rev.1基因组为模板,通过同源重组方法获得WadC基因上、下游同源臂融合片段,并与载体pUC19-SacB连接,构建pUC19-SacB-ΔwadC重组载体,电转至羊种布鲁氏菌Rev.1,构建ΔwadC缺失株（Rev.1ΔwadC）,检测菌株Rev.1ΔwadC的遗传稳定性,比较分析亲本株Rev.1和缺失株Rev.1ΔwadC的生长特性及其在BMDC和RAW264.7细胞中的生存能力。结果显示,试验成功构建基因缺失株,连续传代30次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株Rev.1ΔwadC与亲本株Rev.1生长趋势相似,均在20 h到达对数生长期,44 h进入平台期;侵染BMDC细胞48和72 h时,其胞内存活率显著低于亲本株（P<0.05）;而侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞试验显示,亲本菌株和基因缺失株无显著性差异（P>0.05）。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌WadC基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在BMDC细胞内的存活能力显著变弱,为深入研究布鲁氏菌WadC基因功能奠定基础。 相似文献
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【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同... 相似文献
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【目的】 研究硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidases 4,GPX4）失活如何参与调控脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应及其潜在的分子机制。【方法】 体外培养RAW264.7巨噬细胞,以DMSO为对照,使用0.1~5.0 μmol/L GPX4抑制剂FIN56处理,通过CCK-8法检测细胞活力和Western blotting检测GPX4蛋白表达水平,确定抑制剂最适浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为4组：对照组,添加DMSO培养24 h;FIN56（GPX4抑制剂）组,添加0.5 μmol/L FIN56培养24 h;DMSO-LPS组,DMSO培养24 h后使用LPS （100 ng/mL）刺激3 h;FIN56-LPS组,FIN56培养24 h后使用LPS刺激3 h。各组细胞经培养后,利用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,H2DCFDA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,使用试剂盒法检测细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平,分别使用ELISA和荧光定量PCR检测促炎细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌水平和基因表达量,使用Western blotting法检测Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）信号通路相关蛋白表达水平。【结果】 与DMSO处理相比,0.5 μmol/L FIN56处理巨噬细胞24 h对细胞活性无显著影响（P>0.05）,且显著降低GPX4蛋白表达水平（P<0.05）,故选用0.5 μmol/L FIN56用于后续实验。与对照组相比,FIN56和LPS均显著增加了ROS积累（P<0.05）,而与DMSO-LPS组相比,FIN56-LPS组ROS水平显著升高（P<0.05）。与对照组相比,LPS可显著增加小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量和IL-6含量,以及c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase,JNK）和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,而FIN56可显著下调LPS诱导的IL-6的mRNA表达量和含量及JNK和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,但对p38蛋白（p38 MAPK,p38）、细胞外调节蛋白激酶（phosphorylate extracellular regulated protein kinases1/2,Erk1/2）蛋白表达水平无显著影响（P>0.05）。【结论】 GPX4失活可有效阻断JNK和c-Jun磷酸化,从而特异性抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。该结果可为以GPX4为靶点研发抗炎治疗策略提供理论依据。 相似文献
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本试验通过研究四甲基吡嗪（TMP）对单增李斯特菌感染獭兔载菌量、溶血素、促炎因子（TNF-α、IL-1β和IFN-γ）、免疫器官指数和天然抗体的影响,旨在探讨TMP对单增李斯特菌的抑菌作用。选择断奶獭兔180只随机分为5组,每组6个重复,每个重复6只。对照组饲喂基础日粮,其他4组在基础日粮中分别添加0、50、100、150 mg/kg TMP。饲养试验第1天,4个试验组獭兔每只灌服1 mL（107 CFU）单增李斯特菌株,对照组灌服无菌株的培养液,饲养试验持续14 d。结果表明,TMP降低了獭兔肝脏、脾脏和淋巴结的单增李斯特菌载菌量（P<0.05）。盲肠食糜、肝脏、脾脏和淋巴结载菌量均呈线性下降（P<0.05）。添加TMP使獭兔李斯特菌溶血素和促炎因子（TNF-α和IL-1β）显著降低（P<0.05）,14 d时,李斯特菌溶血素呈线性下降（P<0.05）,促炎因子（TNF-α和IL-1β）均呈现线性和平方下降（P<0.05）。胸腺指数、脾脏指数、血清IgA和IgG在单增李斯特菌感染后下降,随TMP添加量增加而增加,但只有饲喂至7 d时的脾脏指数呈线性上升（P<0.05）。说明日粮中添加TMP可以降低单增李斯特菌感染獭兔组织载菌量,减少单增李斯特菌的毒力,对提升免疫器官指数和天然抗体有积极作用。 相似文献
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【目的】 试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】 利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1 800 V电压、400 Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】 试验成功获得片段大小为522、539、1 054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】 本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 相似文献
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【目的】 探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞（RAW264.7）自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】 首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物（miR-145a-3p mimics）和抑制剂（miR-145a-3p inhibitor）及对照模拟物（NC mimics）,转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因（autophagy-related gene 14,ATG14）的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】 miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低（P<0.01）。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低（P<0.01）、ATG14蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）,miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调（P<0.01）;布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高（P<0.01）,且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组（P<0.05）。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低（P<0.05）。【结论】 miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。 相似文献