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1.
《动物医学进展》2021,42(4)
为制备抗双峰驼FcRn的抗体,首先从NCBI收录的双峰驼FCGRT基因序列中选取编码区,经跨膜结构和信号肽预测分析,截取不含信号肽的膜外序列并构建重组质粒pET-28a-FcRn,然后在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达及表达条件优化,用纯化后的FcRn重组蛋白免疫家兔,制备抗双峰驼FcRn的多克隆抗体,并通过间接ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的FcRn重组蛋白与预期大小一致(34 ku),且以包涵体形式表达,其最佳IPTG诱导浓度为0.3 mmol/L,诱导时间为6 h。ELISA检测抗体效价为1∶32 000,Western blot鉴定该抗体能与重组蛋白发生特异性结合。说明已成功制备了高效价和特异性良好的兔抗双峰驼FcRn多克隆抗体。 相似文献
2.
《动物医学进展》2020,(4)
为获取双峰驼免疫球蛋白M(IgM)重链恒定区的表达产物及抗体,首先在GenBank找出收录的双峰驼IgM、IgA、IgE、IgG重链恒定区基因序列,比对IgM与IgA、IgE和IgG的氨基酸序列,选取一段差异较大的蛋白序列片段,转换成相对应的基因片段,PCR扩增选取的基因片段,插入pET-28a(+)载体构建重组载体,转化进大肠埃希菌BL21,并诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白,后利用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗血清,ELISA和Western blot鉴定获得的血清。结果显示,成功构建了载体pET-28a-IgM,诱导表达的目的蛋白分子质量为18.7 ku,与预期相符。ELISA方法检测抗血清效价为1∶32 000,Western blot结果显示该血清能特异性识别原核表达蛋白,说明双峰驼IgM兔抗血清的成功制备。 相似文献
3.
【目的】制备双峰驼亲环素A(cyclophylin A,Cyp-A)的多克隆抗体,为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列(登录号：XM＿010969543.1)上选取编码区,截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后,与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化,优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔,制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达,Cyp-A蛋白约为17 ku,最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h,杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测,兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1∶64 000,能... 相似文献
4.
禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2020,(6)
试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。 相似文献
6.
《中国畜牧兽医》2019,(12)
本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 相似文献
7.
本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。 相似文献
8.
《畜牧兽医科技信息》2017,(8)
为制备猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3蛋白的多克隆抗体,本研究通过PCR方法扩增US3基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-US3;然后转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG诱导表达His-US3重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot试验表明,该重组蛋白为可溶性表达,并且具有较好的反应原性。将切胶纯化后的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1:10,000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与US3蛋白特异性结合。US3多克隆抗体的制备为US3缺失株的检测及进一步研究US3蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
9.
10.
《中国兽医学报》2019,(6):1075-1079
为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。 相似文献
11.
《中国兽医学报》2020,(3)
以提取的羊传染性脓疱病毒(ORFV)基因组为模版,PCR扩增ORFV122基因,并将该基因连接至原核表达载体pET-28a上,构建出pET-28a-122重组表达质粒。然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经IPTG诱导后成功表达出ORFV122蛋白。利用His标签可与镍离子结合的特性对ORFV122蛋白进行分离纯化。将纯化后的ORFV122蛋白免疫BALB/c小鼠,制备相应的多克隆抗体,并利用Western blot技术检测该抗体的特异性。免疫小鼠获得的抗ORFV122蛋白多克隆抗体经ELISA检测,其效价约为1∶80 000。此外,使用该抗体对ORFV122蛋白的表达规律进行了研究,发现ORFV122蛋白为早期表达蛋白。本试验获得的ORFV122蛋白多克隆抗体为以后ORFV122基因功能的后续研究奠定基础。 相似文献
12.
为制备蛋鸡TRPV6蛋白多克隆抗体,根据其基因序列,设计1对特异性引物,以卵巢组织中提取的总RNA为模板,扩增蛋鸡TRPV6基因1 801～2 176nt的375bp序列,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-TRPV6;将重组质粒转化BL21（DE3）,经IPTG诱导表达TRPV6融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡TRPV6多克隆抗体,分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法和Western blot检测抗体的效价和抗体特异性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a（＋）-TRPV6,SDS-PAGE蛋白电泳检测发现目的蛋白大小约35 000;Western blot分析显示,表达的TRPV6融合蛋白具有良好的免疫原性,其抗体可与大肠杆菌表达的产物特异性结合;ELISA显示其抗体效价达1∶100 000。获得纯化的融合蛋白和多克隆抗体对研究TRPV6钙离子通道在蛋鸡髓质骨形成的作用机理具有重要作用。 相似文献
13.
《中国家禽》2019,(2)
试验拟通过构建A亚群禽白血病病毒(ALV-A) p27基因原核表达载体,从而制备抗p27蛋白鼠源多克隆抗体。将感染ALV-A毒株的DF-1细胞反复冻融后提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR扩增获得ALV-A p27基因,将目的基因克隆至pColdⅠ载体,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌中进行诱导表达,经镍柱纯化后免疫28～32日龄的雌性小鼠,采用间接ELISA法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。试验经PCR扩增出750 bp左右的特异性条带,并成功构建pColdⅠ-ALV-A-p27原核表达载体,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG于18℃诱导表达18～24 h成功得到重组蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测显示,制备的鼠源多克隆抗体血清抗体效价为1∶3 200;Western blot检测结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的p27蛋白。试验结果在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。 相似文献
14.
为深入了解绵羊myostatin基因的表达及调控机理,进行了绵羊myostatin蛋白多克隆抗体的制备.首先将绵羊myostatin基因C-端克隆人含组氨酸标签的表达载体pET-30a-c(+)中,转化大肠杆菌BL21后IPTG诱导表达,然后利用Ni2+亲和层析纯化重组蛋白,薄层扫描及Bradford法分别检测纯化后蛋白的纯度与含量.应用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,用Western blot及免疫细胞化学染色检测抗体特异性.结果,薄层扫描分析纯化后蛋白纯度可达95%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5 mg·mL-1,制备的抗血清效价可达1:250 000以上,Western blot检测证明抗体特异性良好,免疫细胞化学染色表明抗血清可检测剑肌肉细胞中内源性myostatin的表达,说明所制备的多克隆抗体可以应用于进一步研究,有助于阐明绵羊myostatin的表达及调控机理. 相似文献
15.
克隆了NS1蛋白基因并构建了重组表达质粒pTIG-Trx-E-tag-NS1。该质粒在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导后获得了大量的可溶性表达蛋白,重组蛋白表达水平达到了细菌总蛋白的42.16%。经Anti-Etag进行Western blotting检测结果为阳性。后经金属螯和层析纯化获得纯度约为95%的蛋白样品,用纯化后的NS1蛋白直接作为抗原免疫家兔产生抗血清,经ELISA检测抗体效价达1∶256 000,通过Western blot检测,与商品化的抗E-tag单抗对照,显示NS1抗体获得了与抗E-tag单抗同样好的特异性。结果证明,成功地制备了特异性的NS1多克隆抗体。 相似文献
16.
鸡CD4基因片段原核表达及其单抗制备 总被引：1，自引：0，他引：1
将PCR扩增的鸡CD4基因片段克隆到pET-32a原核表达载体,构建获得原核表达重组载体pET-32a-CD4.重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和树脂纯化获得融合蛋白His-CD4.以此融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术制备了1株能够稳定传代并分泌抗CD4多肽单抗的杂交瘤细胞株,命名为3E12.经检测该抗体亚类为IgG2b,单抗腹水的间接ELISA效价为1:105,Western blot结果显示单抗与CD4多肽能特异性地结合. 相似文献
17.
《中国畜牧兽医》2020,(4)
试验旨在构建非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白(rEP153R),并制备抗rEP153R的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1的EP153R基因序列(GenBank登录号:FR682468.1)合成EP153R基因序列,并将其插入pET-28a载体,构建pET-28a-EP153R重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,分别在16和37℃条件下经IPTG诱导12 h进行最适诱导温度筛选。在最适温度下进行重组蛋白的表达,并利用SDS-PAGE、Western blotting进行初步鉴定。切取SDS-PAGE蛋白胶25 ku处条带,利用液相色谱-质谱联用技术鉴定重组蛋白是否正确表达。用纯化的rEP153R免疫小鼠,制备抗rEP153R的多克隆抗体,通过间接ELISA检测其抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果显示,重组菌在16℃表达量较高,并以包涵体形式表达,产物在25 ku处出现明显的条带,与预期蛋白大小相符,表明rEP153R成功表达。液相色谱-质谱联用技术鉴定结果显示,匹配到YIGLINK、NESVLLR和KYIGLINK 3个rEP153R的特异性肽段,证实该蛋白为rEP153R。间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000;Western blotting结果显示,制备的抗体具有较好的特异性。以上结果表明本研究成功表达了rEP153R,并制备了其特异性抗体,为进一步研究该蛋白生物学功能、非洲猪瘟活载体疫苗鉴定等提供了技术支持和材料。 相似文献
18.
为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中发挥的作用，本研究通过合成牦牛自噬相关5(autophagy related 5,ATG5)基因，并将合成的基因插入pET-32a质粒，转化BL21(DE3)感受态细胞，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-Thiogalactoside, IPTG)诱导表达ATG5重组蛋白并纯化，免疫日本大耳白兔，制备牦牛ATG5多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体的效价，蛋白质印迹(Western blot, WB)技术检测多克隆抗体的特异性。通过Western blot、免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)和免疫荧光技术(immunofluorescence, IF)应用所制备的抗体检测ATG5蛋白在牦牛生殖器官中的表达。结果成功构建了pET-32a-ATG5原核表达质粒，转化大肠杆菌IPTG诱导获得了大小约为53 kDa(含His和Trx标签)的重组蛋白；制备的牦牛ATG5多克隆抗体效价为1∶1 280 000,特异性良好。应用显示，ATG5蛋白在牦牛睾丸和输卵管中均有表达。本研究成功制备了牦牛ATG5多... 相似文献
19.
《中国动物传染病学报》2018,(5)
本研究旨在采用原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1毒株毒力基因UK,获得重组蛋白(DP96R),进一步制备并鉴定DP96R重组蛋白的多克隆抗体。首先构建原核重组表达质粒pET-28a-UK并转化BL21感受态细胞,在16℃、0.4 mmol/L IPTG条件下诱导10 h后,检测到目的蛋白以可溶性表达为主,蛋白分子量约为15 kDa。然后采用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗DP96R蛋白多克隆抗体。ELISA结果表明制备的多抗具有良好反应性,Western blot和免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)表明制备的多抗能特异性识别真核表达的DP96R蛋白。DP96R重组蛋白及多克隆抗体的制备为进一步研究DP96R蛋白的生物学功能以及建立ASFV毒株鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。 相似文献
20.
【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。 相似文献