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1.
牛病毒性腹泻病毒感染对猪瘟免疫的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
猪瘟病毒（CSFV）与同属的牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）同源性较高,抗原性上有交叉。本次调查对368份猪瘟免疫猪血清样本进行BVDV抗原检测,其中7份呈阳性,阳性率1.90%。对7份BVDV阳性血清采用ELISA和IHA两种方法检测猪瘟（CSFV）抗体水平,抗体合格率偏低,两者的结果符合率为71%。研究表明：BVDV在一定程度上干扰了猪瘟疫苗的免疫效果,影响抗体水平。 相似文献
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旨在建立猪瘟病毒（CSFV）化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法。该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清均无交叉反应;批内变异系数为1.80%~6.88%,批间变异系数为1.11%~9.18%,重复性好。通过对152份田间猪血清样品的检测并与商品化CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行比较,其Kappa值为0.929,具有高度的一致性。综上表明,本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好、简单快速,可应用于临床血清CSFV抗体的检测。 相似文献
4.
《畜牧与兽医》2020,(11)
为了建立一种经济可靠的猪瘟病毒(CSFV)抗体检测方法,本研究利用杆状病毒表达系统表达可溶性CSFV E2蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备了45株可稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。经CSFV阳性血清阻断试验筛选出4株具有阻断活性的McAb,并经抗原表位鉴定确定单抗15A9识别的是可用于鉴别CSFV和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的线性表位TAVSPTTLR。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的15A9建立了CSFV阻断ELISA抗体检测方法,用此方法检测猪瘟疫苗免疫的猪血清,免疫后2周即可检测到抗体,且该方法检测BVDV阳性血清为阴性。本研究建立的CSFV阻断ELISA抗体检测方法为CSFV的疫苗免疫效果评估及其与BVDV的抗体鉴别提供了一种有效、便捷的方法。 相似文献
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根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的全基因序列,进行对比分析,分别设计合成两对能特异性扩增CSFV、BVDV的引物。经过条件优化后,建立了检测CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法,扩增两种病毒的片段,大小分别为938、650 bp。应用该方法对11批牛睾丸细胞、7批胎牛血清、60个批次的猪瘟细胞苗、10份全血样及10份组织样进行检测。通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,为防止猪瘟细胞苗的污染及进行CSFV和BVDV鉴别诊断提供了有效方法。 相似文献
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以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2021,(9)
为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学检测方法,本研究根据ASFV Georgia2007/1株基因组合成其p72全长基因,并将其克隆至p GEX6p-1载体,构建重组质粒pGEX6p-1-p72并经酶切、PCR和测序鉴定正确后转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示获得了可溶性表达且纯度较高的重组p72蛋白(rp72)。利用GST亲和纯化层析柱纯化,得到浓度为0.2 mg/mL的rp72。以rp72作为包被抗原,通过优化各反应条件建立检测猪血清中非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法,结果显示,rp72最佳包被浓度为1.25μg/mL,封闭时间为37℃1 h;待检血清稀释度为1.100,孵育时间为37℃30 min;羊抗猪IgG-HRP孵育时间为37℃1 h。利用该方法检测280份阴性血清,确定其临界值为0.412。采用建立的间接ELISA抗体方法对PEDV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV、PPV、PCV、E. coli阳性猪血清进行检测,结果显示,除ASFV阳性对照为阳性外,其他病原阳性血清检测结果均为阴性,该方法特异性强;将非洲猪瘟抗体阳性猪血清2倍倍比稀释(1.100～1.6 400)后,利用该方法进行检测,结果显示其检测阳性血清的稀释度为1.3 200倍时OD_(450nm)值仍大于临界值,敏感性高于市售西班牙ASFV阻断ELISA试剂盒检测结果,本研究建立的方法敏感性较高;对该方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间的变异系数均10%,重复性良好。利用本研究建立的ASFV ELISA抗体检测方法(p72)对184份临床血清进行检测,结果显示该方法敏感性为100%,特异性为98.70%;与ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒方法总符合率为98.91%,kappa值为0.961。本研究首次基于rp72建立的非洲猪瘟抗体间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为ASFV抗体检测提供了一种快速、精准、经济、高效的方法。 相似文献
8.
为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。 相似文献
10.
可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立 总被引：4，自引：0，他引：4
以可溶性重组E2蛋白作为抗原,建立了猪瘟病毒(CSFV)血清抗体间接ELISA诊断方法(rE2-ELISA).将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区(A-D)基因克隆到表达栽体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至20℃,获得48 000大小E2融合蛋白,部分目的蛋白以可溶性形式表达.Western blotting试验证实,E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合.亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原,建立了检测CSFV血清抗体的间接rE2-ELISA方法.该方法的特异性试验结果表明,与PRRSV、PCV2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rE2-ELISA和国外同类试剂盒(CSF-Ab-Kit)检测142份田问血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%.因此,rE2-ELISA猪瘟抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合应用在大规模的CSFV血清抗体的检测工作中. 相似文献
11.
《畜牧与兽医》2021,(5)
E0蛋白是猪瘟病毒(CSFV)重要的结构蛋白之一,能刺激机体产生中和性保护抗体,同时也是作为鉴别诊断的标识之一。本研究通过RT-PCR扩增得到石门株E0基因,构建了重组质粒pET-28a-E0,原核表达E0目的蛋白后鉴定了其免疫反应性。将纯化后的目的蛋白进行梯度稀释,建立了ELISA检测方法,优化反应条件如下:最佳蛋白包被浓度2μg/mL,最佳一抗和二抗的稀释倍数分别为1∶100及1∶40 000,一抗孵育时间为30 min,阴阳性临界值分别为0.293和0.418。结果显示组间与组内变异系数均小于10%,无交叉反应性,特异性良好。用建立的方法与商品化试剂盒同时检测206份临床免疫疫苗的血清样本,阳性和阴性及总体符合率分别为96.55%、84.21%及94.17%,表明ELISA方法具有良好的敏感性、稳定性和符合率,可用于临床样本的检测。用该方法检测了85份免疫了E2亚单位疫苗的临床猪血清样本,阳性率为10.59%,表明该方法可初步用于临床CSFV抗体的快速检测及鉴别诊断。 相似文献
12.
本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒（CSFV）E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用 CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65 μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R2值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。 相似文献
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单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立 总被引：9，自引：0，他引：9
分别用原核表达的猪瘟病毒（CSFV）主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6.间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应.将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板（捕捉抗体）,与兔抗CSFV IgG（检测抗体）联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值.最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%. 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2015,(20)
为了解吉林省部分地区2011—2013年度猪瘟疫苗接种后的免疫效果,试验应用ELISA方法对吉林省图们、龙井、四平、双辽、长春、农安、延吉及和龙等8个市(县)的379份猪血清样本进行了猪瘟疫苗接种后的抗体调查。结果表明:在检测的379份猪血清样本中,猪瘟病毒(CSFV)抗体总体阳性率为71.24%(270/379),说明吉林省8个县(市)的猪瘟疫苗接种后均取得了不同程度的效果。其中以检测样本的地区比较,图们市和龙井市猪瘟病毒(CSFV)抗体阳性率最高,分别为100%(10/10)和90.00%(27/30);以检测样本的年龄段比较,母猪抗体阳性率最高,为91.11%(41/45);以检测样本的年度比较,2011年度样本抗体阳性率最高,为93.33%(28/30)。 相似文献
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以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。 相似文献
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为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法，本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体，采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清，通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示，该方法的临界值为25.62%时，ROC的曲线面积最大，为0.9989，诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清，结果显示，除ASFV阳性血清外，其他阳性血清均为阴性，表明特异性强；利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4～1∶2 048)的两种ASFV灭活阳性血清(P1、P2)检测，结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致，敏感性高。利用该方法对3份灭活的... 相似文献
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本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。 相似文献
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为了建立一种能够检测非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性抗体的单抗阻断ELISA方法，本试验首先构建了非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达载体，进而制备并筛选出1株能特异性识别p30蛋白的高亲和力单克隆抗体，采用昆虫杆状病毒表达系统Bac-to-Bac进行该单克隆抗体的表达。以p30重组蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体作为阻断抗体建立了一种非洲猪瘟病毒特异性抗体的检测方法，并验证其敏感性、特异性以及与商品化试剂盒的符合率。结果显示，该方法敏感性为100%,特异性为100%,与商品化试剂盒比较，符合率为98.7%。结果表明，本试验基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法敏感性好、特异性强，结果准确可靠，可用于非洲猪瘟病毒抗体检测。 相似文献
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猪瘟病毒猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科,是世界范围内最重要的猪病病毒。分子特性:单正股RNA,结构蛋白有衣壳蛋白(C)和3种囊膜糖蛋白(E0、E1、E2)。E0蛋白是唯一分泌到CSFV感染细胞血清中的糖蛋白,在机体内可诱导产生中和抗体;E2则是引起猪产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,在猪瘟诊断和新型疫苗的研究上都起着重要的作用。 相似文献
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为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。 相似文献