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试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。 相似文献
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本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒（CSFV）E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用 CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65 μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R2值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。 相似文献
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为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原，本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原，将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化，经序列分析鉴定后，分别使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ与Blp Ⅰ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1（Tox1）、片段2（Tox2）和片段3（Tox3）分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中，构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测，并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示，构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp，与GenBank中相关序列具有高度同源性；3个蛋白片段表达正常，表达量分别达到379.95、447.62与459.82 μg/mL，SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku；因3个片段位置不同，仅Tox3有Western blotting检测条带，与理论预测相符；使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后，二免后14 d，血清经试剂盒检测阳性率达到100%，对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段，且具有较好的免疫原性。 相似文献
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为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。 相似文献
5.
猪鼻支原体(Mycoplasma hyrhinis,Mhr)是猪鼻腔的常在菌。将猪鼻支原体与弗氏佐剂共乳化,免疫新西兰大白兔,获得猪鼻支原体兔抗血清。Western blotting检测其特异性;建立间接ELISA方法检测其抗体效价;将获得的猪鼻支原体兔抗血清分别加入猪鼻支原体和猪肺炎支原体培养物中,进行生长抑制试验。结果显示,制备的猪鼻支原体兔抗血清与猪鼻支原体具有反应原性;抗体效价达1:160 000以上;猪鼻支原体兔抗血清可以显著抑制猪鼻支原体的生长,而对猪肺炎支原体的生长影响较小。本试验结果为鉴定和检测猪鼻支原体提供了方法,也为猪肺炎支原体的分离提供了参考。 相似文献
6.
根据培养物的生长速度和含菌量方面筛选适合猪肺炎支原体CJ株生长的猪血清。配制改良Friis培养基时分别添加6种不同生产厂家的猪血清,由6种不同厂家猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株。从生长时间可知,由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基更适宜猪肺炎支原体CJ株的生长。从测定的含菌量测定结果可知,由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株的含菌量较高。结果表明,由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间短且含菌量高。 相似文献
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通过猪肺炎支原体CJ株接种3种猪肺炎支原体培养基后的生长活性研究发现,与其他2种培养基相比,接种改良Friis培养基培养2~3 d含菌量可达到1.0×109~10CCU/m L,具有生长迅速、含菌量高的特点,可用于猪肺炎支原体CJ株的培养。 相似文献
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为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。 相似文献
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本研究旨在分析牛支原体P48基因的序列特性、蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株P48基因序列（GenBank登录号：CP002188.1）设计特异性引物,运用Overlap-PCR扩增获得P48基因全长,其目的片段连接到pMD19-T载体上并进行测序,利用生物信息学方法分析和预测其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、结构功能（信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构）。结果显示,分离株P48基因序列为1 407 bp,与Mb PG45国际标准株的同源性为100%,聚类于一支;P48基因编码467个氨基酸残基,组成一个无跨膜、稳定的亲水性蛋白;P48蛋白存在信号肽,有44个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（41.76%）,无规则卷曲次之（37.69%）。功能预测显示,在信号转导、胁迫应答、受体等方面该蛋白存在较高概率。本研究成功克隆了分离株P48基因片段,其编码的蛋白是一个稳定可溶、亲水性蛋白,为分析分离株P48基因的特性和功能提供了一定的理论基础和科学依据。 相似文献
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为了解新疆地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况，于2020-2021年从新疆地区规模化猪场采集到326份临床仔猪腹泻病料和肠组织，利用RT-PCR方法对PEDV进行检测，选取部分PEDV阳性样品进行S基因全序列的克隆和测序，并对其序列、遗传进化和抗原表位进行分析。结果显示，326份样品中共有152份样品为PEDV阳性，阳性率为46.6%。选取的11份阳性样品中的PEDV S基因核苷酸(氨基酸)同源性为99.0%～100%(98.2%～99.9%),与GenBank中登录的PEDV参考毒株核苷酸(氨基酸)同源性为92.6%～98.0%(91.2%～97.7%),与经典株CV777核苷酸(氨基酸)同源性为93.1%～93.4%(92.3%～92.7%)。遗传进化分析显示，11份阳性样品均位于GIIa亚群，与中国疫苗株CV777处于不同的分群，说明新疆部分地区PEDV流行株与疫苗毒株CV777亲缘关系较远。序列比对结果显示，11份阳性样品中的PEDV S蛋白均存在氨基酸的插入和缺失，中和表位的COE区域变异较大，这可能会降低常规疫苗的免疫保护作用。结果表明，从分子水平明确了2020... 相似文献
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