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1.
应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。 相似文献
2.
为了同时快速准确的检测产单核细胞李斯特菌以及是否为有毒力的产单核细胞李斯特菌,根据相关文献报道的四重PCR方法,针对该菌的种特异性基因inl A基因进行引物设计,扩增片段大小为800bp,结果应用该PCR法可特异性的扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为97.3%。同时通过对毒力基因inlB,inlC和inlJ的检测用来判断菌株的相关毒力。而同一属的其他菌种无害李斯特菌(L.innocua),韦氏李斯特菌(L.welshimeri)均无特异条带,嗜水气单胞菌(J-1),产气荚膜梭菌(C57-13),大肠埃希菌(ATCC 25922),鼠伤寒沙门菌(C79-32),金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)结果均为阴性。对临床上送检的23份样品进行四重PCR方法检测并同时与国家标准GB/T22429-2008食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,均检测出7份阳性样品。并且四重PCR法表明这7份阳性样品中的产单核细胞李斯特菌均携带有3种毒力因子(inlB,inlC和inlJ),因此该四重PCR法可用于快速鉴定是否是有毒力的产单核细胞李斯特菌,为有效预防控制产单核细胞李斯特菌污染提供技术支撑。 相似文献
3.
李斯特菌套式PCR快速检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank数据库的单核细胞增生李斯特菌iap基因设计2对引物,建立了套式PCR快速检测单增李斯特菌的方法。两对引物分别扩增出约1 500 bp和500 bp片段,与预期大小一致。套式PCR方法灵敏性实验检测极限为10 cfu/mL;人工污染猪肉检测极限为103cfu/mL;整个检测过程可在7 h内完成。采用该法对南海口岸进口的冻肉进行检测,检测出9份阳性,与传统的细菌分离方法完全一致,说明套式PCR方法具有很好的特异性。 相似文献
4.
《动物医学进展》2020,(7)
将环介导等温扩增技术(LAMP)分别与浊度信号检测系统(turbidimeter)和荧光信号检测系统(fluorescence)相结合,建立了LAMP-浊度/荧光单核细胞增生性李斯特菌检测方法。选择单核细胞增生性李斯特菌保守毒力基因iap序列,通过环介导等温扩增引物设计在线软件设计4条特异性引物,进行反应条件的优化,并对建立的LAMP的特异性和灵敏度进行评价分析。结果表明,构建的LAMP-浊度信号检测方法优化后的扩增温度为61℃,菌液最低检测浓度为22.1 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的10倍;LAMP-荧光信号检测方法优化后的扩增温度为64℃,菌液最低检测浓度为2.21 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的100倍;建立的两种LAMP方法的特异性良好,其中1株单核细胞增生性李斯特菌标准菌株和1株本试验分离保存的单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阳性,8株非单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阴性。利用两种LAMP方法对630份肉类及其制品、人工污染样品等进行检测,检出45个LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。结果表明,建立优化的单核细胞增生性李斯特菌LAMP-浊度/荧光检测方法具有快速、特异、灵敏等特点,特别适用于基层兽医、食品及口岸一线部门对单核细胞增生性李斯特菌快速筛查工作。 相似文献
5.
《中国预防兽医学报》2020,(7)
为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×10~2拷贝/μL和10~3cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2014,(10)
将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条检测技术(lateral flow dipstick,LFD)联合,建立了1种可应用于单核细胞增生李斯特菌快速检测的新方法。针对单核细胞增生李斯特菌的actA基因设计3对引物(其中,上游内引物由生物素标记)和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,进行由生物素标记的LAMP扩增反应,并利用LFD对经FITC标记探针杂交的扩增产物完成检测。优化后的LAMP反应条件为65℃反应40min,从细菌基因组DNA提取到LFD结果判断只需90min左右,比常规PCR技术缩短近2h。LAMP-LFD可特异性地检出单核细胞增生李斯特菌,对哈维弧菌等常见弧菌及嗜水气单胞菌等的检测结果为阴性。灵敏性试验表明,LAMP-LFD针对病原纯培养物的检测灵敏度为3.2×101 CFU/mL或0.64CFU/反应,是LAMP检测的10倍,常规PCR检测的100倍;针对人工污染单核细胞增生李斯特菌的原料奶样品的检测灵敏度为1.6×102 CFU/mL或3.2CFU/反应。利用本方法可从采集样品中检测到单核细胞增生李斯特菌,检测结果与传统的细菌分离培养方法结果一致。试验表明,本研究建立的LAMP-LFD技术可特异、准确地应用于单核细胞增生李斯特菌检测,而且灵敏度高、操作简单、检测成本低,有望发展成为单核细胞增生李斯特菌快速检测的有效手段。 相似文献
7.
为了建立一种动物粪便样品中快速、特异、敏感的沙门菌检测方法,根据沙门菌肠毒素stn基因设计一对引物,对不同血清型的沙门菌和非沙门菌进行PCR检测,并对该PCR方法进行反应的灵敏度、模拟粪便样品的最低检出限测定及粪便样品的检测。运用该方法对250份粪便样品进行检测,同时用传统方法进行验证。结果表明,设计的引物特异性好,能专一性扩增出约260 bp条带;该引物灵敏度高,能进行有效检测的核酸最低起始量为43.85 pg,纯菌检测灵敏度达1 cfu/mL。接种沙门菌到粪便样品中,当粪便样本中菌量达103cfu/mL以上时,不需要增菌,沙门菌可立即检出,增菌后检出限可以达到1 cfu/mL。PCR检测250份样品共检出18份阳性,同时传统细菌培养方法证明结果正确。该方法可用于粪便样品的检测。 相似文献
8.
本研究以单核细胞增生性李斯特菌Hly基因和InlA基因作为靶序列设计2对引物,建立了检测单增李斯特菌的二重PCR方法。结果表明,该方法可以同时扩增出单增李斯特菌的Hly基因和InlA基因,而对大肠杆菌、沙门氏菌等食品中的常见致病菌和英诺克李斯特菌均不能扩增出任何条带,表现出良好的特异性。二重PCR方法的最低检测限为104CFU/mL,并能够用于鉴定实验小鼠攻毒后内脏器官的单增李斯特菌分离培养物。该方法表现出良好的特异性、敏感性和通用性,适用于单增李斯特菌的快速鉴别检测。 相似文献
9.
《畜牧与兽医》2016,(8):73-76
根据肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的O抗原编码基因rfb E和H抗原编码基因fli C分别设计引物,建立双重PCR方法。饲料样品人工污染EHEC O157∶H7后进行增菌培养,利用双重PCR进行检测EHEC O157∶H7。结果表明:建立的PCR方法能够特异性扩增出目的条带,敏感性可达到100 cfu细菌。双重PCR方法可以有效地检测出饲料中人工污染的EHEC O157∶H7,人工污染饲料样品经4 h预增菌处理后,该方法的检测下限为20 cfu细菌。本研究建立的双重PCR方法可快速、特异地检测出饲料中污染的EHEC O157∶H7,可用于饲料中EHEC O157∶H7的检测及流行病学调查。 相似文献
10.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(23)
为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。 相似文献
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李斯特氏菌因子血清的制备及食品检测的免疫磁性分离-PCR(MIPA)方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
首先进行了李斯特氏菌因子血清的研制，制备出了可对所有李斯特氏菌分型的 １５ 个 Ｏ 抗原因子和４ 个 Ｈ 抗原因子的因子血清。利用复合因子血清的多克隆抗体包被磁性球，对食品中的单核细胞增多性李斯特氏菌进行免疫磁性分离，并与 Ｐ Ｃ Ｒ 方法相结合，建立了检测食品中单核细胞增多性李斯特氏菌的 Ｍ Ｉ Ｐ Ａ方法（免疫磁性分离—聚合酶链反应方法，ｍ ａｇｎ ｅｔｉｃ ｉｍ ｍ ｕｎｏｐｏｌｙｍ ｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）。对菌液、模拟样品的检测表明，本方法能够有效地克服食品基质、培养基成分和杂菌对 Ｐ Ｃ Ｒ 检验的干扰作用。食品样品在 Ｅ Ｂ增菌液中增菌 １２ ｈ 后，检测的敏感度达 ５ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ Ｌ，可以在 ２０ ｈ 内完成检测。本方法对实际食品样品的检测结果，与国家标准检验方法检测的结果一致。 相似文献
12.
目的了解新疆石河子地区动物性食品中单核细胞增生李斯特氏菌(LM)污染状况。方法在石河子地区选取5个具有代表性动物性食品零售点,对最常食用的生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、冻鸡肉、冻虾和冻带鱼8类动物性食品进行随机采样,采用病原分离培养和PCR法对样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行检测。结果检测8类249份食品样品,细菌分离鉴定阳性样品12份,平均阳性率4.82%;PCR法检测阳性样品36份,平均阳性率为14.46%。结论石河子动物性食品中LM的污染比较普遍,尤以冻鸡肉和冻虾LM污染较重,新鲜猪肉、牛肉和羊肉LM污染程度较轻。 相似文献
13.
In order to compare the plate count method for quantitating Listeria, as published in the "Official Collection of Testing Methods" in section 35 LMBG (L. 00.00-22), to an MPN-method for Listeria based on the same mediums, these two detection methods for Listeria were tested in three sets of experiments and a routine sample status evaluation. A pure broth culture of L. monocytogenes, artificially with L. monocytogenes contaminated ground meat, artificially contaminated and cold stored ground meat as well as 77 ground beef samples from Berlin retail food stores were used in the four trials. The detection limit of the MPN-method is about 66% lower than the plate count method allowing detection of a clearly greater number of Listeria-positive samples from naturally contaminated ground meat. The MPN-method yielded more Listeria spp.-positive samples (rel. 43%) and more L. monocytogenes-positive samples (rel. 21%) versus the colony count method based on the results from the field trial using ground beef samples from retail food stores in Berlin. Nevertheless the standardized colony count method is preferred over the MPN-method for routine use because of its slightly higher productivity and much smaller variation in the results. However, the MPN-method is preferable for epidemiological studies because of the significance of the lower detection level. The random sampling evaluation of ground beef from retail stores indicated that 39% of the samples were Listeria spp.-positive and 31% were L. monocytogenes-positive when using the colony count method. A total of 56% of the meat samples were found to be Listeria spp.-positive and 38% L. monocytogenes-positive when the MPN-method was used. Population levels ranged from 10 to 580 cfu/g (Listeria spp.-positive samples) and from 10 to 270 cfu/g (L. monocytogenes-positive samples) for the colony count method. The MPN-method yielded population levels of 3.6 to 930 MPN/g for Listeria spp.-positive samples and 3.6 to 150 MPN/g for L. monocytogenes-positive samples. L. monocytogenes strains isolated using the colony count method belonged to the following serovars: 1/2a (46%), 1/2b (13%), 1/2c (33%), 3b (4%) and 4c (4%). A similar serovar isolation pattern was found for L. monocytogenes-positive MPN-tubes. The most common serotype was 1/2a (43%), followed by 1/2c (32%) and 1/2b (14%). The serotypes 3c, 4b and 4c were all isolated 4% of the time. 相似文献
14.
A qualitative detection of Listeria monocytogenes was performed in spiked minced pork meat using ELISA, Multiplex-PCR, Microarray and cultural reference method. Minced pork meat in batches of 10 or 25 g was spiked with 25 cfu Listeria monocytogenes per gram and incubated in selective enrichment solutions. During enrichment samples were collected continiously and a Listeria monocytogenes-ELISA, a Multiplex-PCR with electrophoretical detection (Listeria duplex) and a PCR with detection by Microarray (NUTRI Chip) were performed.The enrichment time after which all sub-samples were positive was defined as minimum enrichment time. With the cultural reference method Listeria monocytogenes was detected in 100 % of the samples after a total analysis time of 5 days. With the ELISA kit used in this study positive results were achieved after enrichment for 24 h. Multiplex-PCR with electrophoretical detection was positive after only 16 h of enrichment.The most sensitive detection method was the microarray. Using this technique, an enrichment time of 10 h was sufficient to get positive results in all samples. 相似文献
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目的建立一种能同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的快速检验。方法根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O157:H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应条件,建立可同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的检验,并与miniVIDAS快速初筛方法和SN标准方法进行比较。结果本研究建立的双重荧光PCR方法可同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7,对纯菌的检测灵敏度均低于10CFU/双重荧光PCR反应体系。应用本方法检测36株标准/参考菌株,结果只有9株目的菌标准/参考菌株出现特异性扩增,其余27株非目的菌均呈阴性反应。定量检测重复性试验结果,批内和批间的变异系数均小于2%。应用本方法检测人工染菌样品,结果与miniVIDAS和SN方法检测结果一致,但检测时间比miniVIDAS快了3倍,比SN标准快了10多倍。结论本研究建立的双重荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点,可在8小时内完成样品沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的检验。 相似文献
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为分析来自豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的分布变化,本研究以分离自豫西地区市售鸭翅的11株单增李斯特菌分离株为研究对象,利用PCR方法进行8种毒力基因的检测(inlA、inlB、virR、mprF、dltA、dltB、dltC、dltD基因)。结果显示有3株出现了基因缺失,dltA基因检出率为90.9%(10/11),dltC、mprF基因检出率均为81.8%(9/11),其他基因全部呈阳性。这些毒力基因在单增李斯特菌分离株中分布广泛,对豫西地区市售鸭翅具有潜在的威胁,应引起食品监管部门的高度关注。 相似文献
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Faecal samples, collected from 200 healthy animals in Antwerp Zoo, were examined for the presence of pathogenic Listeria spp. A two-stage standard isolation (ISO) method was combined with immunomagnetic separation (IMS). ALOA agar, a chromogenic isolation medium, differentiating Listeria spp. on the basis of beta-glucosidase and phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PIPLC) activity, was compared with PALCAM agar. Confirmation of the isolates was based on conventional biochemical tests and a disc test, which detects a specific aminopeptidase produced by all Listeria spp. except Listeria monocytogenes. Listeria spp. were isolated from 42 (21.0%), L. monocytogenes from 14 (7.0%), and Listeria ivanovii from two (1.0%) faecal samples. The application of IMS after primary enrichment detected pathogenic Listeria spp. in 12 (6.0%) samples. The ISO method, combining primary and secondary enrichment, detected pathogenic Listeria spp. in 15 (7.5%) samples. The sensitivity of IMS compared to the ISO method was 73.3% and the specificity was 99.5%. ALOA agar was superior to PALCAM agar for isolation of Listeria spp. The disc test identified all L. monocytogenes isolates. IMS after primary enrichment was a suitable screening method, but secondary enrichment increased the number of positive samples. 相似文献