牛病毒性腹泻病毒链特异性SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用   总被引：1，自引：1，他引：0  

刘存  邓永  梁琳  李金祥  张彦明  崔尚金 《畜牧兽医学报》2019,(10)

为了对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)复制过程中正、负链RNA进行定量检测,通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5′端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA。同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对,建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssRT-qPCR)方法,对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测。结果表明,以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(+)RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(-)RT-qPCR]在10~2～10~7拷贝范围内具有良好的线性关系,线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3;敏感性试验结果显示,ssRT-qPCR敏感性较好,ss(+)RT-qPCR最低检测下限为10拷贝,ss(-)RT-qPCR最低检测下限为100拷贝。重复性试验结果显示,所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1%,方法重复性良好。特异性试验显示,所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应,特异性较好。利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析,结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后,BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势。以1 MOI剂量感染MDBK细胞,BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异,整体呈上升趋势。10、1 MOI接毒剂量接种细胞后,BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平,以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平。BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性。该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述,为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段。  相似文献   

1株犬副流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究     

刘畅  秦彤  梁琳  由欣月  王春凤  钱爱东  李金祥  崔尚金 《中国畜牧兽医》2019,(3)

试验旨在分离鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对其生物学特性进行研究。用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺脏组织,盲传4代,收集72 h病毒液进行RT-PCR鉴定、电镜观察、血凝试验、热敏性试验、紫外照射试验及病毒一步生长曲线的测定,同时扩增N基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,试验成功从出现咳嗽、流鼻涕等呼吸系统疾病症状的病犬肺脏中分离出1株CPIV,命名为CPIV-BJ01;RT-PCR扩增结果发现,在534 bp处有特异性目的条带。病毒电镜观察发现,其超微结构呈圆形、有囊膜、直径在80～200 nm之间;血凝试验显示,病毒在4和37℃均能凝集1%猪红细胞,与报道的CPIV血凝特性一致;病毒对热敏感,长时间高温下病毒毒价会随之下降;紫外照射可使病毒在短时间内对细胞的感染性急剧下降。病毒一步生长曲线测定结果显示,在12～48 h病毒高速增殖,细胞培养液中病毒滴度急剧上升,之后趋于稳定。CPIV N基因序列与19株有代表性的副流感病毒N基因相比,其核苷酸序列同源性为97.1%～99.8%。遗传进化分析表明,CPIV-BJ01与PIV5 1168-1(登录号:KC237064.1)和PIV5 ZJQ 221(登录号:KX100034.1)位于同一分支上,亲缘关系较近。  相似文献   

提高农民素质是贫困地区建设社会主义新农村的关键     

梁琳 《甘肃农业》2007,(11):10-11

农民群众是建设社会主义新农村的主体,而提高农民的综合素质则是建设社会主义新农村的关键。新农村建设不只是简单的通过建新屋、铺新路就能完成的。它涉及方方面面,既有经济发展问题,又有社会进步问题,不但有产业结构调整方面的内容,还有体制改革深化层面的内容,这就需要农民不断提高素  相似文献   

鸽圆环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用     

亓玉卓  梁琳  朱亚丽  梁瑞英  贾亚雄  单虎  崔尚金 《中国家禽》2021,(3):22-27

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Rep保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1.43×10²~1.43×10⁸copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.998;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1.43×10²copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的1000倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于0.8%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床鸽血清样品检测结果显示,PiCV阳性率达38.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(28.7%),说明该方法具有良好的适用性。研究结果PiCV的流行病学调查、病原学监测及定量研究奠定了基础。  相似文献   

瘦素对牛体外胚胎早期发育阻滞的克服     

阎芃  倪和民  刘云海  郭勇  梁琳  郑雪莹 《畜牧兽医学报》2014,(5):763-768

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一株犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组测序与其遗传变异分析     

刘子宁  魏津  汤新明  梁琳  崔尚金 《中国农业大学学报》2021,26(11):157-164

为分析本实验室分离的犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组序列与其遗传变异情况,对CPIV-BJ01株全长进行分段扩增并测序,拼接获得全基因组序列,与GenBank发布的27株副流感病毒5型分别进行全基因组和包膜糖蛋白(F、SH和HN)核苷酸及氨基酸序列的相似性比对,分析其遗传进化关系。结果显示,CPIV-BJ01毒株与犬源PIV5 1 168-1亲缘关系最近,核苷酸相似性为99.9%,氨基酸相似性为99.8%。CPIV-BJ01的F和HN基因序列变化较为保守,核苷酸和氨基酸变化均在4%以内,其中F蛋白的氨基酸变化形成一处新的O-糖基化位点;CPIV-BJ01株的SH基因序列与其他演化分支毒株差异显著,核苷酸相似性为84.4%~97.0%,氨基酸相似性为31.8%~95.6%。综上,CPIV-BJ01株基因组序列与前人报道的毒株相比,在F、HN基因和部分非编码区存在核苷酸或氨基酸序列的改变,同时F蛋白存在糖基化修饰的改变,均为该毒株所特有,该研究结果丰富了中国CPIV流行株的基因组信息。  相似文献   

氨基酸平衡饲粮饲喂肉用仔鸡效果   总被引：3，自引：0，他引：3  

林映才  蒋宗勇  梁琳  刘汉林 《中国饲料》1995,(21)

通过饲养试验对配制的4种氨基酸（AA）平衡的肉用仔鸡饲粮进行研究：（I）总AA平衡的玉米─豆粕型饲粮；（Ⅱ）有效AA平衡的低蛋白质水平的玉米─豆粕型饲粮；（Ⅲ）总AA平衡的非常规蛋白型饲粮；（Ⅳ）有效AA平衡的非常规蛋白型饲粮。结果表明，在整个饲养期，I组和Ⅱ组的生产性能（平均增重、采食量和饲料效率）和成活率无显著差异（P＞0.05）,都极显著地优于Ⅲ、Ⅳ组（P＜0.O1）；Ⅳ组的生产性能在生长前期极显著优于Ⅲ组（P＜0.01），在生长后期显著优于Ⅲ组（P＜0.05）。经济效益以Ⅱ组最佳，I组次之，Ⅳ组优于Ⅲ组。这一结果提示，配制饲粮时必须考虑AA的利用率，这有利于更精确地满足肉鸡生长的需要，提高生产性能和经济效益。在满足有效AA需要的基础上，适当降低肉鸡饲粮蛋白质水平是可行的。  相似文献   

发酵血粉饲养黄羽肉鸡的效果     

何廷  梁琳 《畜牧兽医科技信息》1992,(1):7-8

  相似文献   

安东种鸡在广东饲养繁殖试验报告     

樊丽珍  梁琳 《畜牧兽医科技信息》1990,(1):5-8

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安乐鸡及其杂交组合饲养观察试验     

樊丽珍  梁琳 《广东畜牧兽医科技》1987,(4)

前言几年来的实践证明,快长肉鸡生长快,饲养期短,对市场的肉食供应起了不可缺少的作用,但由于其肉含水份高,鲜味欠佳,而广东港澳以及东南亚一带地区的消费者有喜爱肉质鲜美的地方黄羽鸡的传统习惯,据资料统计,香港市场每年销售的黄羽肉鸡达到3600万～4000万只,广州市居民的销售量也不相上下,另外还有澳门、东南亚地区等总  相似文献