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通过 PCR条件选择 ,组装了可用于确诊鹅细小病毒 (goose parvovirus,GPV)感染的试剂盒。首先根据 Gen Bank中已发表的鹅细小病毒不同株的核苷酸序列 ,设计并合成了 GPV特异性简并引物 ,利用该引物确定 PCR扩增条件 ,并鉴定了扩增产物的特异性。根据上述扩增条件 ,组装 GPV诊断试剂盒。试剂盒共有 3个反应管 ,贮于 - 2 0℃ ,应用时取 1号管 ,加入煮沸的肝脏悬液上清 ,2、3号管分别为阴性和阳性对照。按固定条件扩增 ,结果显示 ,待检病料的检出率在 96 %以上。该试剂盒操作简单 ,效果稳定 ,可用于 GPV感染的确诊 相似文献
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在稀有密码子的改造基础上,人工合成了849 bp的蚓激酶F-Ⅲ-1全长cDNA序列,并以其为目的基因,构建了以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pBLK和pLN-bCP-LK。2种质粒分别以200,500,1 000,2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,以纤维蛋白平板溶圈法(FAPA)检测该基因表达后奶样的纤溶活性。结果表明:注射后3~78 h,奶样有明显纤溶活性,其中6~16 h活性最高。500μg pBLK质粒与其他3个剂量溶圈直径之间差异显著(P<0.05),而其他3个剂量之间差异不显著;pLN-bCP-LK质粒的各剂量溶圈直径之间差异均不显著,且2种质粒的同剂量溶圈直径之间差异也不显著。以上结果表明,改造后的蚓激酶基因可以在泌乳期黑白花奶牛乳腺中实现瞬时表达,以500μg的注射剂量表达效果最佳。 相似文献
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狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中稳定表达条件的优化及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
将狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因按正确的读码框克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-1中,转化至大肠杆菌Rosetta株,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,相对分子量约为82 kD,与预期大小一致。Western-blot检测结果表明,融合蛋白能与多克隆阳性血清发生特异性反应。为获取大量ELISA包被用核蛋白,试验还借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、菌密度I、PTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。结果表明:27~32℃,OD5500.3~0.4,IPTG 0.06 mmol/L、诱导至OD550值不再增加时为最佳诱导表达条件。优化后经扫描分析显示,所表达融合蛋白占菌体总蛋白的20%以上。经包涵体纯化和亲和层析纯化,可获得纯度较高的GST融合蛋白。 相似文献
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以狂犬病病毒糖、核蛋白“二价“DNA疫苗pVGN免疫3月龄至8岁龄家犬302条,分为2组:Ⅰ组201条,两侧股内侧肌注;Ⅱ组101条,单侧股内侧肌加单侧耳廓皮内联合注射.免疫3次,剂量为每条犬每次300μg,于试验的0d和35d分别进行.三免后21d用间接ELISA检测特异性抗体,Western-blot分析抗体组成,间接免疫荧光和小鼠中和试验测定抗体中和效价.结果显示,三免后抗体阳转率为58%,组间抗体水平差异不显著(P＞0.05),机体产生了抗糖蛋白、核蛋白2种特异性抗体,抗体稀释8～512倍后,每50μL可以中和100TCID50狂犬病病毒SRV9,个别稀释到2048倍仍具有中和作用,抗体稀释8～16倍后每15μL可中和120MICLD50狂犬病病毒CVS,少部分犬三免后抗体稀释16～32倍后能中和300MICLD50狂犬病病毒CVS.说明该疫苗具有良好的免疫原性,且诱生的抗体能发挥病毒中和作用. 相似文献
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野生狐和貉狂犬病流行于新疆、内蒙古和黑龙江地区,是当地牛、羊和骆驼等家畜狂犬病的主要传染源。在国内尚无野生动物口服疫苗的前提下,对家畜进行狂犬病灭活疫苗接种,具有重要的公共卫生学意义。本研究利用国产犬用狂犬病灭活疫苗(CVS-11株)对牛进行了免疫效果和安全性评价。以不同剂量疫苗肌内注射免疫成年牛350头,通过比较免疫后狂犬病病毒中和抗体水平和持续期,确定犬用狂犬病灭活疫苗(CVS-11株)在牛的最佳免疫剂量为1次性注射2剂量疫苗,免疫持续期为1年。结果表明,犬用狂犬病灭活疫苗(CVS-11株)免疫牛时,具有较高的免疫原性和安全性,适用于牛等大型动物的狂犬病注射免疫。 相似文献
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【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。 相似文献
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小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
应用PCR技术,从小鼠基因组中克隆了1.6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5′上游调控序列,经酶切和测序证实与已知序列基本一致.为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达,将此序列与报告基因CAT融合,构建了pWAP-CAT-polyA乳腺定位表达载体,脂质体包裹后,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达.分别于家兔分娩后1～10 d采奶,用ELISA检测乳汁中CAT含量.结果表明,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达,表达水平在家免分娩后1～5 d较高. 相似文献